Richiami di Bioenergetica

Presentazione sul tema: "Richiami di Bioenergetica"— Transcript della presentazione:

1 Richiami di Bioenergetica

2 Nei Sistemi Chimici abbiamo a che fare col Potenziale Elettrochimico
Il Potenziale Elettrochimico è l’Energia disponibile nelle Reazioni Chimiche per compiere Lavoro

3 Potenziale Elettrochimico
J/Mol Unità = Energia/Mole Dmo=DGo/mol

4 Dm = SNimprodotti – SNimreagenti
L’Energia in una Reazione 1 A + 1 B C In generale: Dm = SNimprodotti – SNimreagenti Ni = Rapporto Molare dei Reagenti Per la nosra particolare reazione: Dm = 2mC – 1mA – 1mB

5 All’Equilibrio: Dm = 0 Energia del Sistema Equilibrio

6 Per una Reazione che va verso l’Equilibrio:
Dm < 0 Energia del Sistema Dm Dm Equilibrio

7 Il Potenzale Elettrochimico è la risultante di diversi fattori:
1) Composizione Molecolare 2) Concentrazione 3) Potenziale Elettrico 4) Pressione Osmotica, …

8 Energia dovuta alla Composizione Molecolare
Energia Conformazionale Energia Entropica contro Stabilità dei legami Solubilità-Interazione con il Solvente Coefficiente di Partizione Misurata in Condizioni Standard

9 Condizioni Standard Le Condizioni Standard sono le condizioni della reazione appropriate per l’esperimento con i reagenti ad una concentrazione Molare: Concentrazione 1 Molare In Acqua Pura pH=7 Pressione = 1 atmosfera

10 Energia di Concentrazione
L’Energia del Gradiente di Concentrazione: = RT ln([C]/Molare) R = Costante dei Gas (Joules*Mole-1*K-1) T = Temperatura (Kelvin, K)

11 Energia del Potenziale Elettrico
L’Energia dovuta alle cariche in un Campo Elettrico: = z F y z = Cariche (Moli di Carica/Mole) y = Potenziale Elettrico (Energia/Coulomb di Carica) V = J/C F = Costante di Faraday: 105 Coulomb/Mole di Carica

12 Potenziale Elettrochimico
[Conc] [Conc]o m = mo + RT ln zFy [Conc]o è la Concentrazione in Condizioni Standard

13 A B Cambiamento Conformazionale Dm = mB – mA= 0 All’Equilibrio:
= (moB +RT ln([B]))-(moA + RT ln([A])) (moB + RT ln([B]))-(moA + RT ln([A])) = 0 -RT ln ([B]) + RT ln ([A]) = moB – moA = Dmo

14 A B [B]/[A] = exp (-Dmo/RT) = Keq Cambiamento Conformazionale
All’Equilibrio: (moB + RT ln([B]))-(moA + RT ln([A])) = 0 -RT ln ([B]/[A]) -RT ln ([B]) + RT ln ([A]) = Dmo Risolvendo rispetto a: [B]/[A] = exp (-Dmo/RT) = Keq Distribuzione di Boltzmann

15 Modello di Gating del Canale

16 Voltaggio-dipendenza del gating
Le particelle di gating agiscono all’interno della proteina-canale con modalità interpretabili in termini di una distribuzione di Boltzmann. Consideriamo un sistema a due stati nel quale ciascun canale è aperto dal movimento di una singola particella di gating di carica z Secondo il modello di H&H un unico movimento della particella di gating causato da una variazione del campo elettrico provoca un cambiamento conformazionale del canale: Energia Barriera energetica   + Le posizioni  e  corrispondono a due minimi nel profilo energetico e vi è una singola barriera energetica tra di esse. In una popolazione di N canali simili, n1 avranno la loro particella di gating in posizione  e n2 in posizione , cosicchè n1+n2=N.

17 Equazione di Boltzmann
della meccanica statistica Mette in relazione le probabilità di una particella di trovarsi nello stato  o nello stato  con le differenze di energia u2-u1=Du dei due stati: k  cost. di Boltzmann T  temp. assoluta u2-u1 è espressa in joules Stato 1 Stato 2 Energia D u La particella spende il minor tempo nello stato ad energia maggiore

18 1o caso: il campo elettrico transmembrana è zero
In assenza di campo elettrico (E=0) la distribuzione di Boltzmann dell’energia della popolazione di molecole sarà: Dove: n1 il no di particelle con energia u1 in posizione (1) (canale chiuso) n2 il no di particelle con energia u2 in posizione (2) (canale aperto), u2-u1 è la variazione di energia libera (DG) relativa al cambio conformazionale da 1 a 2 Quindi, in assenza di un campo elettrico la differenza di energia conformazionale (u2-u1) tra le posizioni 1 e 2 corrisponde al lavoro chimico (w) per muovere ciascuna particella di gating da 1 a 2.

19 2o caso: il campo elettrico transmembrana è  da zero
Se esiste un campo elettrico (E0) la componente energetica posseduta dalla particella in quanto elettricamente carica sarà: -zeV z  no di cariche in ciascuna particella di gating e  carica elementare dell’elettrone (=4.8·10-10 ues=1.6·10-10 coulomb V  potenziale elettrico Quindi, includendo la componente di energia (lavoro) elettrica, avremo: Se nel nostro sistema il canale è aperto quando la particella di gating è in (2) e chiuso quando è in (1), la frazione di canali aperti è anche uguale alla frazione di particelle in (2):

20 Ritorniamo all’equazione:
Ponendo si ottiene: dove V1/2 è il voltaggio V al quale metà dei canali sono aperti (Po=0.5). L’equazione di Boltzmann dà una curva sigmoide in un grafico lineare di Po in funzione di V. Quanto più elevata è z tanto maggiore è la pendenza della curva Fraz. di canali aperti Po Notare che quanto più è elevata la carica z, tanto maggiore è la pendenza della curva Ricordiamo che w corrisponde al lavoro per muovere ciascuna particella di gating dalla posizione 1 alla 2 ovvero, la differenza di energia tra le due posizioni in assenza di un potenziale di membrana.

21 Fittando i dati sperimentali di H&H per il Na e per il K con l’equazione si ottiene z(K)3.9 e z(Na) 4.8 Z=4.8 (Na) Z=3.9 (K) -80 -60 -40 -20 20 40 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 C o n d u t a z ( S ) m Voltaggio (mV) 1 P r b . c l e p Gmax

22 Che significato ha il valore di z?
Semplicemente potrebbe essere la quantità di carica mossa da un lato all’altro della membrana durante il processo di gating. Potrebbero però esistere più particelle di gating per canale. Per esempio con quattro particelle che si muovono indipendentemente, il valore di z ottenuto applicando la precedente equazione si riferirebbe a ciascuna singola particella e la carica di gating per l’intero canale sarebbe 4z.

23 Alcune definizioni….. Dmo=DGo/mol F/RT=eo/kT R=8.3143 joule·K-1·mol-1
k= ·10-23 joule·K-1 R=NA·k (6.0222·1023 mol-1· ·10-23 joule·K-1) NA≡Numero di Avogadro: n. di molecole contenute in una mole (6.0222·1023mol-1) F=96490 C·mol-1 V=statVolt (299.8 volt)=erg/ues=10-7 joule/0.333 ·10-9 C eo ≡carica elementare dell’elettrone ( ·10-18 C)

24 A 0 mV L’attività del canale è caratterizzata dalla relativa stabilità dello Stato Attivato rispetto a quello chiuso e non dipende dalla posizione delle cariche rispetto al campo elettrico, dal momento che non c’è un gradiente di potenziale elettrico.

25 C EM A 0 mV + + m(C)=mo(C) m(C)=mo(C) m(A)=mo(A) m(A)=mo(A) EM EM
Energia EM Nessun Effetto EM Nessun Effetto C Bagno m (Gate) = zG · F · 0 mV = 0 + + Membrana EM 0 mV A m (Gate) = zG · F · 0 mV = 0 Distribuzione di Boltzmann Basata solo su Dmo Citoplasma

26 A -70 mV L’attività del canale è caratterizzata dalla relativa stabilità dello Stato Chiuso e dipende dalla posizione delle cariche rispetto al campo elettrico, dal momento che c’è un gradiente di potenziale elettrico.

27 C EM A -70 mV + + m(A) mo(C) mo(A) m(C) EM EM Energia Stabilizzante
Destabilizzante C Bagno m (Gate) = zG · F · 0 mV = 0 + + Membrana EM -70 mV A m (Gate) = zG · F · -70 mV < 0 La distribuzione di Boltzmann shifta verso lo stato C Citoplasma

28 a +40 mV L’attività del canale è caratterizzata dalla relativa stabilità dello Stato Attivato e dipende dalla posizione delle cariche rispetto al campo elettrico, dal momento che c’è un gradiente di potenziale elettrico.

29 C EM A +40 mV + + m(C) m(A) m(C)=mo(C) m(A)=mo(A) EM EM Energia
Destabilizzante EM Stabilizzante C Bagno m (Gate) = zG · F · 0 mV = 0 + + Membrana EM +40 mV A m (Gate) = zG · F · 40 mV > 0 La distribuzione di Boltzmann shifta verso lo Stato A Citoplasma

30 voltaggio-dipendenti
Il gating dei canali voltaggio-dipendenti ovvero Come fa il voltaggio ad aprire i canali? Il controllo dell’attività dei canali per mezzo del voltaggio è la chiave che sta alla base dell’eccitabilità neuronale e del signalling

31 Canali ionici voltaggio-dipendenti
Famiglia di canali a 6 domini transmembrana (TM) Questa è una delle 4 (pseudo)subunità H5 Il poro è delineato da 4 subunità o pseudosubunità Ciascuna contiene 6 segmenti TM (S1-S6) e una regione H5 (loop P) I canali ionici voltaggio-dipendenti contengono sensori del voltaggio intrinseci Il segmento S4 corrisponde al sensore del voltaggio Vi appartengono: Canali voltaggio-dipendenti del Na+, Ca2+ e K+ Canali del K+ Ca2+-attivati Canali cationici attivati dall’iperpolarizzazione, ecc.

32 X 4

33 2 2 Attiva la spirale 4 4 5 5 Nel canale del K+ “Shaker”, ciascun segmento S4 contiene 7 residui basici regolarmente distribuiti ogni 3 aa. Canale chiuso: la 2a Arg di S4 è seppellita nel bilayer Canale aperto: la 2a Arg fuoriesce dal lato extracell., mentre il 4o e 5o residui basici si muovono dal citosol all’interno del bilayer

34 Il movimento del sensore del voltaggio, facendo aprire il canale, produce una corrente ionica
+50 mV -100 mV Corrente Ionica 1000 pA

35 Il movimento del sensore del voltaggio produce anche una corrente di gating
+50 mV -100 mV Corrente Ionica 1000 pA come è possibile smascherare la corrente di gating? 10 pA 1 ms Corr. di Gating Soluzione senza K+

36 Il movimento del sensore del voltaggio produce una corrente di gating
+50 mV -100 mV Ig = dqg/dt  qg = ∫Igdt 10 pA Corr. di Gating 1 ms Soluzione senza K+ Carica totale di gating = cariche elementari /canale Numero dei canali

37 Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica
1 2 3 4 5 6 7 IL R VI R LV R VF R IF K LS R HS K GL 4 R  K 2  q/n R  neutral AA - (e charges) -2 -4 K=lisina R=arginina

38 Mutazioni in S4 Riducono il Movimento di Carica
1 2 3 4 5 6 7 IL R VI R LV R VF R IF K LS R HS K GL 4 R  K 2  q/n R  neutral AA - (e charges) -2 -4

39 Nel canale del K+ “Shaker” la presenza di 4 segmenti S4 che fungono da sensori del voltaggio intrinseci spiega la “ripida” dipendenza dell’attivazione del canale dal voltaggio. Le 4 subunità identiche si muovono verso il lato extracellulare in due fasi distinte: Prima indipendentemente l’una dall’altra; Poi in maniera cooperativa, portando all’apertura.

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41 MacKinnon_Nature01473.pdf MacKinnon_Nature01580.pdf MacKinnon_Nature01581.pdf

42 Struttura del Canale K+ Voltaggio-Dipendente KvAP da Aeropyrum pernix
La visione del tetramero del canale K+ è dal lato intracellulare. Ciascuna subunità è colorata separatamente e contiene 6 a-eliche (etichettate S1-S6 alle loro estremità N-terminali nella subunità blu). Le eliche S5-S6 formano il poro e il filtro di selettività per il K+. Le eliche S4 formano i sensori del voltaggio. Gli ioni K+ sono colorati in verde.

43 Struttura del Canale K+ Voltaggio-Dipendente KvAP da Aeropyrum pernix
Visione laterale. È indicato lo spessore della membrana (40 A)

44 Conformazioni del Sensore del Voltaggio
Vista Laterale: Le linee orizzontali demarcano approssimativamente i contorni della membrana. Si intravvedono 6 ioni K+; K1-K4 sono nel filtro di selettività. I residui comprendono il filtro di selettività e ne è mostrata l’ossatura in bianco. I gruppi C=O della catena principale di tali residui formano legami di coordinazione con gli ioni K+. Chiuso: Vr=-100 mV

45 Conformazioni del Sensore del Voltaggio
Vista Laterale: Le linee orizzontali demarcano approssimativamente i contorni della membrana. Si intravvedono 6 ioni K+; K1-K4 sono nel filtro di selettività. I residui comprendono il filtro di selettività e ne è mostrata l’ossatura in bianco. I gruppi C=O della catena principale di tali residui formano legami di coordinazione con gli ioni K+. Aperto: depolarizz.

46 Lo stato chiuso prevale al potenziale di riposo della cellula (~ -100 mV).
Lo stato aperto è favorito da una depolarizzazione della membrana. In questo modello, S2 è assunto rimanere inalterato durante lo switch; S3a e S3b subiscono dei riarrangiamenti sostanziali; si ipotizza che anche la connessione tra S4-S5 sia rimodellata.

47 Ingrandimento del Sensore del Voltaggio
Una Subunità, Chiusa: Delle eliche S2-S4 è mostrata l’ossatura. Le arginine che conferiscono la sensibilità al voltaggio, sono mostrate come bastoncini colorati. Sono mostrati anche l’ossatura del filtro di selettività e gli ioni K+. chiuso

48 Ingrandimento del Sensore del Voltaggio
aperto In aggiunta al movimento della “paletta sensore del voltaggio", notare nello stato aperto la formazione di un ponte salino (legame ionico) tra l’Asp 80 e l’Arg 133.

49 Accessibilità dei Residui
Nella conformazione chiusa, i residui evidenziati in magenta sono esposti allo spazio interno. Interno

50 Accessibilità dei Residui
Nella conformazione aperta, i residui evidenziati in rosso sono vicini allo spazio esterno (10 Å) o si estendono verso di esso. Esterno

51 La struttura del canale del K+ KvAP è descritta in: A
La struttura del canale del K+ KvAP è descritta in: A. Jiang Y, Lee A, Chen J, Ruta V, Cadene M, Chait BT, & MacKinnon, R. (2003) "X-Ray Structure of a Voltage-Dependent K+ Channel". Nature 423: 33 I movimenti delle palette del voltaggio sono descritti in: B. Jiang Y, Ruta V, Chen J, Lee A, & MacKinnon, R. (2003) "The principle of gating charge movement in a voltage-dependent K+ Channel". Nature 423: 42 [1ORQ.pdb & 1ORS.pdb]

52 FINE