Metodi post-genomici in biochimica cellulare

Presentazione sul tema: "Metodi post-genomici in biochimica cellulare"— Transcript della presentazione:

1 Metodi post-genomici in biochimica cellulare

2 Metodi post-genomici

3 Metodi post-genomici Quantitative analysis of systems biology by taking advantage of available genomic information at the level of SNPs analysis associated to disease or drug response mRNA (transcriptomics) Protein (proteomics) Post-translational modifications (aka “modificomics”) Surface exposure (surfomics) Protein-protein interactions (interactomics) Small metabolites (metabolomics) and their relations (metabonomics) Many other fantasy exercises (glycomics, lipidomics, allergenomics, degradomics, excluding – perhaps – comics...) G.B Smejkal, “I’m an –omics, you’re an -omics... ” Exp. Rev. Proteomics 3 (2006)

4 Metodi post-genomici Modelli cellulari e animali Trascrittomica
Proteomica Systems biology

5 Modelli cellulari e animali (farmacologici e/o genetici)

6 Modelli cellulari (farmacologici e/o genetici)
Facilità di mantenimento e trattamento Possibilità di combinare trattamento farmacologico e manipolazione genetica Utili per riprodurre un singolo meccanismo Cellule umane (o murine)

7 Modelli animali (farmacologici)
Intero organismo vs. cellule isolate Trattamento sistemico o lesione chimica locale Possibilità di valutare l’effetto anterogrado/retrogrado

8 Modelli animali (e vegetali?!?) (genetici)
Organismi modello Genoma noto Non solo topo! Vita breve Invertebrati (e piante…)

9 Trascrittomica

10 Trascrittomica

11 Trascrittomica

12 Trascrittomica

13 Trascrittomica Distanza Euclidea Correlazione di Pearson

14 Proteomica Non c’è correlazione tra quantità di mRNA e quantità di proteina (Gygi et al., 1999) Il proteoma è un’istantanea del fenotipo a livello biochimico Il proteoma tiene conto del processing delle proteine S.P.Gygi et al., Mol. Cell. Biol. 19, 1720 (1999)

15 Proteomica Metodi basati su 2-DE Metodi “gel-free”

16 Proteomica (2-DE) Principi della 2-D elettroforesi I dimensione
Isoelettrofocusing in condizioni denaturanti: separazione in base al punto isoelettrico II dimensione SDS elettroforesi: separazione in base al peso molecolare

17 Proteomica (2-DE) Vantaggi
• Possibilità di caricare campioni non purificati • Risoluzione estremamente alta • I gel 2 –DE sono collettori di frazioni proteiche molto efficienti • Proteine sono protette all’interno della matrice del gel Problematiche • Gradiente di pH • Limiti nel determinare proteine poco rappresentate • Capacità di caricare campione • Proteine idrofobiche • Proteine ad alto peso molecolare

18 Proteomica (2-DE) A global, unbiased approach
Hypothesis-generating rather than hypothesis-driven A “find the difference” game between two conditions Control Treated

19 Proteomica (2-DE) Marco Francesca Giovanni Maria

20 Proteomica (2-DE) Proteine Colorazione Acquisizione
Analisi di immagine

21 Proteomica (2-DE) Find the difference… Controllo Esordio Precoce
Esordio Tardivo

22 Proteomica (2-DE) Find the difference…

23 Proteomica (2-DE) Metodi statistici

24 Proteomica (2-DE) Identificazione delle proteine
Peptide mass fingerprinting LC-MS/MS Western blot (non globale)

25 Proteomica (2-DE) Peptide Mass Fingerprinting

26 Proteomica (2-DE) Peptide Mass Fingerprinting

27 Proteomica (2-DE) Peptide Mass Fingerprinting (Limiti)
La proteina non è presente nel database La proteina è ricca di modificazioni co/post-traduzionali Lo spot nasconde più di una proteina

28 Proteomica (2-DE) Peptide Mass Fingerprinting (Limiti)
La proteina non è presente nel database La proteina è ricca di modificazioni co/post-traduzionali Lo spot nasconde più di una proteina

29 Proteomica (2-DE) LC-MS/MS

30 Proteomica (gel-free)
Metodi quantitativi (ICAT, iTRAQ, …) Protein arrays

31 Proteomica (gel-free)
ICAT

32 Proteomica (gel-free)
iTRAQ

33 Proteomica (gel-free)
Protein arrays (e SELDI)

34 Systems Biology Necessità di analizzare un elevato numero di informazioni (Network analysis) Necessità di arricchire un ridotto numero di informazioni (Network enrichment)

35 Systems Biology Interazione fisica Stesso pathway (KEGG)
Stessa Gene Ontology (GO)

36 Systems Biology

37 Un esempio (realizzato a Busto…)

38 Un modello cellulare per identificare nuovi meccanismi e nuovi bersagli terapeutici
2 Quali condizioni? Trova le differenze! Cosa hanno in comune? Un nuovo bersaglio! Il Modello 1 6 5 3 4

39 Il modello cellulare La linea cellulare umana SH-SY5Y incamera dopamina, ma la immagazzina con difficoltà nelle vescicole Simile a quello che succede nella malattia di Parkinson α-sinucleina La linea viene trasfettata stabilmente per esprimere α-sinucleina or β-galattosidasi I livelli di α-sinucleina sono alterati nella malattia di Parkinson (Gómez-Santos et al., 2003)

40 Le condizioni sperimentali
-Sinucleina Controllo NON trattate Controllo trattate con Dopamina α-Sinucleina α-Sinucleina trattate con Dopamina Dopamina Effetto combinato

41 Trova la differenza!

42 Trova la differenza! 8 Dopamina 11 α-Sinucleina 4 Entrambi i fattori
sintesi proteica mitocondri stress ossidativo citoscheletro trascrizione mitocondri trasduzione del segnale

43 Strumenti bioinformatici
Cosa hanno in comune? Dopamina α-Sinucleina Entrambi i fattori Strumenti bioinformatici

44 Generare nuove ipotesi
NF-κB Apoptosi

45 Ritorno al modello VDAC2 VDAC2 4h Inibitore GSK3β ctr ctr inib DA
DA inib DA Inibitore GSK3β Alberio, Fasano, Rizzuto e altri, in preparazione

46 Partendo dal modello cellulare, verso nuovi bersagli terapeutici
Alterazione della Dopamina Proteine che cambiano NF-κB, i VDACs, GSK3β. Nuove terapie?