Multicolor labeling - CGH

Presentazione sul tema: "Multicolor labeling - CGH"— Transcript della presentazione:

1 Multicolor labeling - CGH
Lezione 2 By NA

2 MULTICOLOR LABELING By NA

3 Aberrazioni numeriche
Aberrazioni strutturali traslocazioni, inserzioni By NA

4 Sistema combinatoriale:
MULTICOLOR FISH Il primo esperimento di FISH multicolore è stato descritto nel 1992 da Ried e coll. con l’impiego delle sette combinazioni ottenibili miscelando tre differenti fluorocromi, FITC, TRITC e IR680, per marcare fino a sette sonde genomiche. Sistema combinatoriale: n=3 fluorocromi 2n-1=7 combinazioni By NA

5 MARCATURA COMBINATORIALE
RAPPORTO DI MARCATURA (percentuali diverse di fluorocromi) By NA

6 MULTICOLOR PROBES M- FISH: multiplex FISH, 5 fluorocromi (Speicher et al 1996); SKY: Spectral karyotyping FISH, 7 fluorocromi (Schrock et al 1996); COBRA FISH: combinatorial binary ratio labelling, 4 fluorocromi (Tanke et al 1999); Rx-FISH: rainbow cross species colour banding, cariotipo a bande colorate (Muller et al 1997); MCB: multicolor banding con 24 cocktail di painting parziali per pseudobandeggio (Chudoba et al 1999); cenM-FISH: multicolor FISH con 23 sonde centromeriche (Nietzel et al 2001); M-TEL: multicolor FISH con 41 sonde telomeriche (Brown et al 2000). By NA

7 M-FISH, SKY & COBRA (Multiplex-FISH,
Spectral KarYotyping & COmbined Binary RAtio labelling) : finalità analisi simultanea di tutto il corredo cromosomico con un approccio rapido (come le bandeggiature Q, G e R): un singolo esperimento per lo studio dell’intero cariotipo; sistema affidabile di caratterizzazione simultanea di tutti i riarrangiamenti cromosomici; strumento di screening per l’identificazione di nuovi riarrangiamenti tumore-specifici e nuove regioni bersaglio. By NA

8 M-FISH, SKY & COBRA: applicazioni
Identificazione di cromosomi marker, ring, hsr e double minutes; Corretta identificazione di traslocazioni quando il pattern di bandeggiatura non è ottimale, o in metafasi di scarsa qualità; Caratterizzazione di traslocazioni complesse. Identificazione di inserzioni cromosomiche. Individuazione di riarrangiamenti ‘criptici’. By NA

9 M-FISH, SKY & COBRA: limiti
- Necessita’ di cellule in metafase con cromosomi non sovrapposti perche’ possano essere rivelati riarrangiamenti(piccole duplicazioni/delezioni, traslocazioni criptiche) che coinvolgono regioni di dimensioni >3Mb - Non e’ possibile evidenziare inversioni paracentriche ed alcune pericentriche - E’ difficile valutare la presenza di riarrangiamenti a carico dei telomeri By NA

10 Sistema combinatoriale:
A = Rodamina B = Texas Red C = Cy 5 D = FITC E = Cy 5.5 Esempio Si ottiene così una specifica fluorescenza, o spettro, per ciascun cromosoma Sistema combinatoriale: n=5 fluorocromi 2n-1=31 combinazioni By NA

11 M-FISH methodology By NA

12 Si ottiene infine l’immagine totale combinando le informazioni delle acquisizioni effettuate con i sei filtri. By NA

13 By NA

14 Cariotipo con M-FISH Cariotipo complesso By NA

15 Cariotipo con SKY By NA

16 SKY Marker cromosomico By NA

17 SKY Traslocazione complessa By NA

18 COBRA-FISH RATIO IMAGE FIRST BINARY IMAGE By NA

19 conclusioni Vantaggi Limiti riarrangiamenti intracromosomici
marcatori con neocentromeri o privi di centromero risoluzione: 3Mb riarrangiamenti tra più cromosomi identificazione piccoli marcatori (<17p) Limiti risoluzione: riarrangiamenti submicroscopici telomerici riarrangiamenti tra più cromosomi due esperimenti sequenziali singolo esperimento Vantaggi M-TEL-FISH cen-M-FISH M-FISH/SKY/COBRA By NA

20 Position on Chromosome
Conventional CGH Test Genomic DNA Reference Genomic DNA Normal Tumour Cot-1 DNA Ratio Position on Chromosome gain deletion By NA 20

21 0.8 1 1.2 RAPPORTO DI FLUORESCENZA VERDE/ROSSO
Software per l’analisi delle immagini digitali By NA

22 By NA

23 Small cell lung carcinoma
By NA

24 Array CGH By NA

25 Northern Blot Espressione genica Sequenza ibridatata su mRNA By NA 25
G3PDH Sequenza ibridatata su mRNA Espressione genica By NA 25

26 Northern Blot 30,000 Geni 30,000 Northerns By NA 26

27 Evoluzione: Cambiamento prospettico che ribalta la visione statica
Evoluzione: Cambiamento prospettico che ribalta la visione statica. Introduce in tempo come variabile RIVOLUZIONE By NA 27

28 Evoluzione: Cambiamento prospettico che ribalta la visione statica
Evoluzione: Cambiamento prospettico che ribalta la visione statica. Introduce in tempo come variabile RIVOLUZIONE By NA 28

29 Evoluzione: Cambiamento prospettico che ribalta la visione statica
Evoluzione: Cambiamento prospettico che ribalta la visione statica. Introduce in tempo come variabile RIVOLUZIONE By NA 29

30 Position on Chromosome
CGH su microarrays Test Genomic DNA (Tumour DNA) Reference Genomic DNA Cot-1 DNA gain deletion Ratio Position on Chromosome Ratio Position on Sequence By NA 30

31 By NA 31

32 By NA 32

33 Chip fabrication Conditioni controllate, chips identici si possono comparare facilemente e con precisione. By NA 33

34 SNP array SNP AA * * AB * * * BB * * Chromosome By NA 34

35 SNP array genoma maschile normale
By NA 35

36 SNP array genoma esempio patologico?
By NA 36

37 SNP array 3 delezioni? By NA 37

38 Condivisione genoma genitore - figlio 1/2 fratelli 1/2
zio - nipote 1/4 cugini primi 1/8 cugini secondi 1/16 By NA 38

39 Ricombinazione mitotica(MR)
Descritta in Drosophila da Curt Stern (1936) By NA 39

40 Ricombinazione mitotica(MR)
By NA 40

41 Ricombinazione mitotica(MR)
By NA 41

42 Ricombinazione mitotica(MR)
By NA 42

43 Ricombinazione mitotica(MR) origina una popolazione a mosaico
By NA 43

44 SNP array nei tumori UPD segnalata in alcuni tumori: Breast Cancer
Retinoblastoma Ulveal melanoma Wilms tumour Myeloproliferative disorders (9p) Haematopoietic malignancies By NA 44

45 SNP array AML By NA 45

46 SNP array AML By NA 46

47 UPD + + By NA