Introduzione alla Spettroscopia Dr. Francesca Benevelli

Presentazione sul tema: "Introduzione alla Spettroscopia Dr. Francesca Benevelli"— Transcript della presentazione:

1 Introduzione alla Spettroscopia Dr. Francesca Benevelli
NMR 2D con Gradienti C.I.G.S. Modena 9 Dicembre 2003 Dr. Francesca Benevelli Bruker Biospin srl

2 Spettroscopia 2D 1D 2D preparation detection preparation detection
Durante un esperimento 1D, la magnetizzazione viene PREPARATA, ad esempio con un impulso a 90º Successivamente si procede alla DETECTION, durante la quale si raccoglie il FID 1D preparation detection In uno spettro 2D si introduce un’ulteriore fase, chiamata EVOLUTION In alcuni esperimenti (ad es. NOESY) un periodo di MIXING viene inserito tra EVOLUTION e DETECTION 2D preparation detection evolution mixing increment

3 Spettroscopia 2D Quindi la magnetizzazione evolve in due “ambiti temporali”: evolution e detection Da ciascuno, tramite FT, si estrae un diagramma nel dominio delle frequenze, cioè uno spettro 2D COME? Eseguo una prima serie di FT lungo t2, creando F2 (2) Ogni spettro si distingue per un diverso evolution time 1

4 Si ottiene così la seconda dimensione
Spettroscopia 2D Mettendo gli spettri, uno sopra l’altro, ogni picco è modulato, cioè cambia di intensità La modulazione dipende dall’evolution time. Una seconda serie di FT viene eseguita lungo t1, creando F1 (1) Si ottiene così la seconda dimensione N.B. Per spettri 3D o oltre, basta aggiungere piú evolution times 2

5 Spettroscopia 2D F2 = 1H F2 = X proprietá ETERO- CORRELAzZIONI COLOC
J long range XHCORR J dirette HMBC HSQC HMQC OMO- CORRELAZIONI COSY COSYPS TOCSY Intero spin system NOESY Dipolar coupling ROESY

6 Spettroscopia 2D Eterocorrelata J diretta (HSQC o HMQC)

7 Spettroscopia 2D Eterocorrelata J long range (HMBC)

8 Spettroscopia 2D Omocorrelata J diretta (COSY)

9 Spettroscopia 2D TOCSY CH Me2 Me1

10 Spettroscopia 2D NOESY N-CH3 CO-CH-N

11 Cos’è un gradiente? Gradiente di B0 è un campo magnetico aggiuntivo (per esempio lungo l’asse z) la cui intensità dipende dalla posizione

12 Cos’è un gradiente? L’applicazione del gradiente rende la velocità di precessione dipendente dalla posizione del nucleo. L’effetto globale è una DEPHASING.

13 Cos’è un gradiente? Il gradiente provoca la perdita di fase della magnetizzazione, che può essere rifocalizzata da un secondo gradiente. Si comporta come una disomogeneità (T2). x y G1 G2

14 Hardware La bobina di gradiente è immersa in un cilindro ceramico per che fa da supporto meccanico e da dissipatore

15 Hardware Il generatore di corrente è una scheda del BSMS, che eroga fina a 10A. Il gradiente totale risultante è dell’ordine dei 50G/cm

16 Cos’è un gradiente? S I gradienti possono operare da soli o in coppia
Un gradiente si caratterizza per forma intensità durata Gk p16 S d16 Intensità del gradiente (Gk). E’ il valore massimo che assume l’impulso di gradiente Durata del gradiente: p16. In alta risoluzione si usa 1ms – 1.5ms Gradient stabilization delay: d16=100usec Forma del gradiente (S). Di solito sine.100

17 Sintassi dei gradienti
NELLA SINTASSI GP I GRADIENTI SONO TRATTATI COME IMPULSI 1 ze 2 d1 3 p1 ph1 d0 50u UNBLKGRAD p16:gp1 d16 p0 ph2 d13 p16:gp2 4u BLKGRAD go=2 ph31 d1 wr #0 if #0 id0 zd lo to 3 times td1 exit ph1=0 2 ph2= ph31=0 2

18 A cosa serve il gradiente?
In spettroscopia i gradienti di campo hanno varie funzioni: Imaging Distruggere magnetizzazioni non desiderate (spoil gradient) Sopprimere segnali indesiderati Selezionare dei cammini di coerenza Misurare coefficienti di diffusione

19 Imaging Posso acquisire un FID con il gradiente accesso:
1H G L’acquisizione in presenza di gradiente fa si che la velocità di precessione (e quindi la frequenza a cui viene acquisito il segnale) dipendono dalla posizione: imaging. Questa procedura si usa anche per il gradshim.

20 Gradienti di Spoil Mixing time t1 Si applica, per esempio nel NOESY.
1H t1 Mixing time G Durante il mixing time del NOESY, la magnetizzazione “utile” è lungo z. Tutto ciò che è rimasto sul piano trasversale va eliminato o con cicli di fase oppure con gradienti. Gli spoil gradient lavorano “da soli” e l’unica esigenza che devono soddisfare è di essere sufficientemente intensi da eliminare le coerenze indesiderate.

21 Eliminazione di picchi indesiderati
Si possono eliminare in modo molto efficiente segnali indesiderati, come ad esempio quello del solvente. 1H 90 180 180 G Il gradiente rifocalizza solo i segnali che hanno subito l’echo: gli altri vengono ulteriormente defocalizzati. (ZGESGP) In questo esperimento i gradienti lavorano in coppia.

22 Eliminazione di picchi indesiderati: es e wg
Nell’excitation sculpting l’impulso sagomato è un 180° di solito SQUA , di durata 2 ms. La potenza viene calcolata con l’au-program PULSE. Altre sequenze con i gradienti sono P3919GP e ZGGPWG. Utilizzano entrambe la tecnica watergate, ma P3919GP usa impulsi hard per la selezione del picco mentre ZGGPWG usa impulsi sagomati. P3919GP: d19=1/SW; p27=p0=p1; pl18=pl1 ZGGPWG: shape scelta in base a selettività

23 Selezione di coerenze (a) (b)
I gradienti sono alternativi ai cicli di fase. Le COERENZE assieme alle popolazione dei singoli livelli energetici quantizzati descivono completamente un sistema di spin. COERENZA si verifica quando piú spin si muovono all’unisono, con la stessa fase. Per esempio: Dopo un ’impulso di 90°, la parte polarizzata degli spin si muove all’unisono nel moto di precessione. E’ questo “moto coerente” che ci permette di osservare la FID L’energia fra spin che si muovono all’unisono e spin defocalizzati è quasi la stessa. In un caso (a) ho coerenza, nell’altro (b) no (a) (b)

24 Coerenze a più spin coerenze osservabili popolazioni single quantum
Quando ci sono più spin accoppiati, questo modello non è sufficiente a descrivere tutto coerenze osservabili popolazioni single quantum double quantum

25 Ordini di Coerenza “p” e impulsi
Impulsi di 90° eccitano tutti gli ordini di coerenza accessibili al sistema di spin. Impulsi di 180° invertono p in –p. 90° 90° 180° +3 +2 +1 -1 -2 -3

26 COSY 90° 90° t2 t1

27 COSY con i gradienti +1 Echo -1 Rec. +1 Antiecho -1 Rec.

28 Evoluzione del chemical shift durante il gradiente
Durante l’applicazione del gradiente evolve anche il chemical shift. Per non avere distorsioni la fase inserisco un impulso di rifocalizzazione di 180 gradi.

29 COSYDQF +1 -1 Rec. +2 -2

30 Gradienti e NMR E1=10 (H*2) E2=20 (H*(-1)) Eexpt=0 Eexpt=0
Per il cammino di coerenza selezionato si deve verificare che l’effetto totale dei gradienti sia nullo durante l’intero esperimento. In pratica: Eexpt=0 E=G n(n pn) Per esempio: COSYDQF, G1=10, G2=20 +2 Da verificare il rapporto di polarizzazione -1 Rec. E1=10 (H*2) E2=20 (H*(-1)) Eexpt=0

31 Strategia dell’esperimento inverso
Parto da magnetizzazione H: robusta, più nuclei polarizzati Trasferisco la magnetizzazione H al nucleo X, via accoppiamento J (INEPT e simili) Evoluzione in X ritrasferisco la magnetizzazione ad H, per sfruttare la maggiore sensibilità del nucleo 1H Detection su H Vantaggi: Parto da magnetizzazione “robusta” (H) Detection su 1H, più sensibile Svantaggi: Devo eliminare tutto il segnale 1H non accoppiato a C13. Sono richieste caratteristiche strumentali ottimali (impulsi esatti, strumentazione stabile).

32 INEPT e HSQC (heteronuclear single quantum coherence)
Decoupling I S t1  1H 13C inept retro-inept t2 x z A ( 90x )I y B free precession D = 1/ 4 J IS Iz Iy C 180x )S Sz 90y E -2IxSz Ix antiphase magnetization) G acquire on N or C channel 1/ 2 [ -Iy - 2IxSz ] -2IzSy Sy + w I _ p ) t 1

33 HSQC (heteronuclear single quantum coherence)

34 HSQC (heteronuclear single quantum coherence)

35 Quadrature detection inn F1: echo-entiecho
Per ottenere spettri 2D phase sensitive si possono usare varie metodologie (States, TPPI, States-TPPI, etc.). Per esperimenti eteronucleari inversi di solito si usa echo-antiecho, in cui si selezionano alternativamente i cammini echo o antiecho in t1. assorbimento dispersione magnitude “misto”

36 HSQCsi (sensitive improved)

37 HMQC (heteronuclear multi-quantum coherence)
  t1 Decouple

38 HMQC con gradienti- QF 1H 13C 1H 13C

39 Allungo il raggio di azione: eterocorrelate long range
Ricostruisco le connettività Trovo J piccole (debole accoppiamento): tempi lunghi per il trasferimento di coerenza (10/100ms) Non disaccoppio: ottengo infos sulla J long range Non disaccoppio: i picchi sono sfasati  spettro magnitude Filtro via (se voglio) le connettività short range

40 HMBC (heteronuclear multi-bond correlation)
Il primo 90° 13C crea 2Q J diretta, che viene cancellata con cicli di fase.

41 Esperimenti tipici COSY: cosygpqf cosygpmfqf HSQC: hsqcetgpsi
hsqcedetgp HSQC-TOCSY: hsqcdietgpsi HMBC: hmbcgpqf Per l’esecuzione si può sempre usare RPAR