PCR real time nel monitoraggio dell’infezione da BKV V.Salotti e A.Azzi.

Presentazione sul tema: "PCR real time nel monitoraggio dell’infezione da BKV V.Salotti e A.Azzi."— Transcript della presentazione:

1 PCR real time nel monitoraggio dell’infezione da BKV V.Salotti e A.Azzi

2 BK virus nelle urine dopo ultracentrifugazione

3 La scoperta di BKV Gardner SD, Field AM, Coleman DV, Hulme B. New human papovavirus (B.K.) isolated from urine after renal transplantation. Lancet 1971

4 Infezione da BKV Infezione primaria Latenza Riattivazione Prima infanzia Via respiratoria Rene trapiantato rene linfociti cervello ….. Tratto urinario viruria

5 Infezione da BKV: eziopatologia Soggetti immunocompetenti Trapiantati di midollo Trapiantati renali AIDS asintomatica Cistite emorragica Stenosi ureterale Meningite, infezione disseminata ….. Interstitial nephropathy (PVAN) Tumori ?

6 Ricerca del DNA virale PCR qualitativa Nelle urine Soggetti sani17 % gravidanza15 % Trapiantati di midollo77 % AIDS 40 % Trapiantati rene[25 %] Nei linfociti Soggetti sani53 % Trapiantati di midollo 57.5 % AIDS 62.5 %

7 Ricerca del DNA di BKV nel plasma /siero La presenza di virus libero in circolo nei trapiantati di rene è considerata un indicatore di patologia renale BKV – associata. Livelli significativi da definire

8 Organizzazione del genoma dei polyomavirus

9 PCR qualitativa per DNA di BKV

10 PCR quantitativa competitiva per BKV L’estrazione dei campioni La sintesi del competitore La calibrazione del competitore La reazione La rivelazione

11 Sintesi del competitore Mutagenesi sito-specifica/hot start PCR NcoII: 5’TATTTTGCCATGGAGATATG 3’ NcoI: 5’CATATCTCCATGGCAAAATA 3’ Enzima NcoI ccatgg ggtacc

12 PEP 1 target TATA sequence Nco II Nco IPEP 2 Mutagenesis obtained with the primer Nco II GCGC GCGC Mutagenesis obtained with the primer Nco I 5’ 3’ Denaturation and Rinaturation Extension with the primers PEP 5’ standard Fig.. 1 PCR site-directed mutagenesis.

13 Mix + Taq gold 5  l estratto campione urina 40 fg – 200 fg – 1 pg – 5 pg – 25 pg competitore

14 PCR quantitativa competitiva per DNA di BKV: la rivelazione

15 Quantificazione dei prodotti della PCR Software Molecular Analyst (Bio-Rad) y. Y= OD banda comp x 1.88 OD banda campione.. x log[conc competitore] calcolo retta di regressione e coefficiente di regressione lineare

16 Trapiantati di midollo Cistite emorragica Carica virale nelle urine PCR quantitativa competitiva

17 PCR quantitativa competitiva per BKV Limiti –Tempi –Costi –Manualità –Sensibilità –riproducibilità