TECNICHE ANALITICHE SEPARATIVE

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1 TECNICHE ANALITICHE SEPARATIVE
Le tecniche analitiche si dividono in due grandi famiglie: tecniche separative e tecniche identificative. Le tecniche separative hanno come primo obbiettivo la separazione degli analiti nel campione. Sono impiegate quando i campioni sono molto complessi. La identificazione è affidata a tecniche di rivelazione adatte (es: spettrofotometria, spettrometria di massa).

2 GAS CROMATOGRAFIA (GC)

3 FASI STAZIONARIE PER GLC

4 TEMPERATURA PROGRAMMATA IN GLC
I tempi di ritenzione crescono con il logaritmo dell’abbassamento di temperatura della colonna

5 RIVELATORI PER GC

6 Metodi di cromatografia liquida
Criteri in base alla struttura e proprietà chimiche degli analiti

7 IL SISTEMA HPLC miscelatore precolonna e colonna computer pompa
rivelatore sistema di introduzione del campione raccoglitore di frazioni Contenitori dei solventi che costituiscono la fase mobile

8 IL SISTEMA HPLC I componenti fondamentali del sistema HPLC sono:
una pompa che regola e mantiene costante il flusso della fase mobile. Poiché la fase stazionaria è costituita da particelle di diametro micrometrico impaccate, il flusso della fase mobile attraverso la fase stazionaria richiede un’elevata pressione; un sistema di introduzione del campione; una colonna contenente la fase stazionaria. Può essere presente una precolonna (o colonna di guardia) che riduce la quantità della matrice del campione che entra nella colonna analitica. La colonna può essere termostatata per migliorare la riproducibilità della separazione; un rivelatore che evidenzia, mediante segnali elettrici, gli analiti che eluiscono dalla colonna.

9 CROMATOGRAFIA LIQUIDA SU COLONNA
I tipi di cromatografia liquida su colonna possono essere classificati in base alla natura del processo di separazione: cromatografia di adsorbimento : la fase stazionaria è un adsorbente e la separazione è basata su un susseguirsi di stadi di adsorbimento e desorbimento. cromatografia di ripartizione : la separazione è basata sulla ripartizione tra fase mobile e fase stazionaria, entrambe liquide. cromatografia di scambio ionico : la separazione è basata sull’ interazione ionica tra fase stazionaria ed analiti. cromatografia di esclusione dimensionale : la separazione è basata sulle dimensioni relative degli analiti.

10 CROMATOGRAFIA DI SCAMBIO IONICO
+ - flusso La fase stazionaria presenta gruppi ionici sulla superficie, di carica opposta rispetto a quella degli analiti. Questa tecnica viene utilizzata per analiti di tipo ionico o ionizzabili. Quanto è più forte la carica del campione, tanto più verrà trattenuto all’interno della colonna. La fase mobile è un tampone acquoso in cui il pH e la concentrazione vengono regolati per controllare il tempo di eluizione degli analiti.

11 CROMATOGRAFIA DI ESCLUSIONE DIMENSIONALE (SEC)
flusso La separazione è basata sulla dimensioni e massa molecolari degli analiti La fase stazionaria è costituita da materiale di porosità controllata. Le molecole grandi eluiscono prima di quelle piccole. Infatti le molecole che sono troppo grandi per entrare nei pori della fase stazionaria hanno un percorso più breve nella colonna, rispetto a quelle che entrano nei pori. La porosità della fase stazionaria può essere controllata per ottenere la separazione di molecole in uno specifico intervallo di dimensioni.

12 CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE
flusso La fase stazionaria è un solido. La separazione è dovuta all’alternarsi di fenomeni di adsorbimento e desorbimento. CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE La fase stazionaria è un liquido. La separazione è basata sulla partizione degli analiti tra la fase stazionaria e la fase mobile (solubilità relativa). Le specie che hanno più affinità per la fase stazionaria rispetto alla fase mobile saranno maggiormente ritenute. flusso

13 CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO
FASE NORMALE E IN FASE INVERSA Spesso non è possibile definire in maniera chiara se la separazione degli analiti avvenga in base ad un processo di adsorbimento o di ripartizione, ovvero entrambi. Si parla quindi di cromatografia di adsorbimento/ripartizione, che viene suddivisa, in base alle polarità relative delle due fasi: Cromatografia in fase normale : la fase stazionaria è polare (ad es. silice), la fase mobile è non polare (ad es. n-esano o tetraidrofurano). I campioni polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli non polari o poco polari. Cromatografia in fase inversa (RP) : la fase stazionaria è non polare (idrocarburo), la fase mobile è polare (ad es. acqua o alcol). I campioni poco o non polari vengono trattenuti nella colonna più a lungo di quelli polari. Utilizzando uno o l’altro metodo, l’ordine di eluizione dei composti si inverte, anche se non sempre in maniera esattamente speculare.

14 CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE/ADSORBIMENTO
FASE STAZIONARIA In cromatografia liquida di adsorbimento, la fase stazionaria è un solido poroso. In cromatografia liquida di partizione si utilizza una fase stazionaria liquida, che riveste la superficie delle particelle di supporto. La fase stazionaria liquida è oggi costituita da una fase stabile chimicamente legata alla supporto, detta bonded phase (BP). Il supporto (o matrice) è generalmente costituito da silice: i gruppi OH della silice (silanoli) vengono utilizzati per legare chimicamente la fase stazionaria. Le fasi legate possono essere polari (ad es. con un ammino gruppo o un ciano gruppo), utilizzate in fase normale; oppure apolari (ad es. con una catena alchilica, come quella octadecilica, C18), usate in fase inversa.

15 FASE MOBILE IN CROMATOGRAFIA LIQUIDA
In tutti i tipi di cromatografia liquida, tranne quella di esclusione dimensionale, la fase mobile gioca un ruolo fondamentale nella separazione. E’ possibile utilizzare un solvente singolo, tuttavia molto spesso è necessario utilizzare una miscela di due o più solventi per ottenere la fase mobile di composizione ottimale. Durante l’analisi è possibile effettuare un’eluizione isocratica (mantenendo costante la composizione della fase mobile) o un’eluizione in gradiente (la composizione della fase mobile varia durante l’analisi). L’eluizione in gradiente viene utilizzata quando la miscela di analiti comprende composti di caratteristiche molto diverse tra loro e serve per migliorare la separazione e ridurre i tempi di analisi.

16 SCELTA DELLA FASE MOBILE
La scelta dei solventi da utilizzare per la fase mobile dipende dal tipo di cromatografia: nella cromatografia di adsorbimento/ripartizione la polarità dei solventi è il parametro più importante; nella cromatografia a scambio ionico sono importanti il pH e la forza ionica; nella cromatografia ad esclusione dimensionale deve essere considerata la solubilità degli analiti nella fase mobile ed il suo effetto sulle dimensioni e l’arrangiamento sterico delle molecole degli analiti.

17 SCELTA DELLA FASE MOBILE
Non tutti i solventi possono essere utilizzati in HPLC. Devono infatti possedere queste caratteristiche: devono essere miscelabili in diverse proporzioni non devono interagire chimicamente con gli analiti o gli altri solventi non devono alterare la risposta del rivelatore (ad es. assorbire significativamente all’UV) devono avere una bassa viscosità devono essere poco tossici e poco infiammabili devono essere non troppo costosi La fase mobile più comune in HPLC a fase inversa (RP-HPLC) è costituita da acqua miscelata con metanolo, acetonitrile, oppure tetraidrofurano (THF).

18 LA COLONNA CROMATOGRAFICA
Le dimensioni della colonna vengono scelte in modo da raggiungere il miglior compromesso in funzione di: capacità di carico, consumo di solventi, risoluzione desiderata e velocità dell’analisi. Le tipiche colonne cromatografiche analitiche sono lunghe cm, hanno diametro interno di 2-5 mm e sono riempite con materiali a granulometria di 5-10 m. Le colonne più moderne (per cromatografia ad alta velocità) sono lunghe 3-5 cm e sono riempite con materiali di 3-5 m. Sono inoltre disponibili colonne microbore di lunghezza 25 cm, diametro interno di 1 mm e materiali di 10 m. Le colonne cromatografiche preparative sono lunghe almeno 25 cm ed hanno diametro interno di almeno 7.

19 SCELTA DELLA FASE STAZIONARIA

20 Rivelatori per cromatografia liquida HPLC
aTipo: S: selettivo; G: generale

21 Accoppiamento cromatografia/MS
Caratteristiche di un rivelatore ideale per cromatografia Non alterare la risoluzione cromatografica, ossia non produrre nel rivelatore una miscela dei composti separati. Avere la massima sensibilità possibile. Essere universale, cioè rivelare tutti i composti eluiti. Fornire quante più informazioni possibile sulla struttura dei composti eluiti, per permetterne l’identificazione. Essere selettivo, cioè consentire l’identificazione dell’analita in miscela. Dare un segnale proporzionale alla concentrazione. Avere un fattore di risposta costante, o quantomeno prevedibile. Non danneggiare i prodotti. Non produrre artefatti. Consentire la deconvoluzione dei picchi cromatografici, ossia la scomposizione dei picchi non risolti nei solo componenti. Avere il più basso rapporto costi/prestazioni possibile.

22 Schema di uno spettrometro di massa
Computer Segnale Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Rivelatore Campione Ioni Ioni torr Campione Sistema di vuoto

23 Componenti di uno spettrometro di massa
Sistema di introduzione del campione Consente di trasferire il campione dal suo stato originario (solido, liquido o gassoso) ad una forma adatta alla ionizzazione. Sistema di ionizzazione E’ il dispositivo in cui si formano gli ioni gassosi degli analiti o di loro frammenti Analizzatore di massa E’ un dispositivo che separa gli ioni gassosi in base al loro rapporto m/z, nello spazio (ossia deviandoli su diverse traiettorie) o nel tempo (ossia facendo loro percorrere la stessa traiettoria in tempi diversi).

24 Componenti di uno spettrometro di massa
Rivelatore E’ un dispositivo che consente di misurare la quantità di ioni che emergono dall’analizzatore di massa, convertendone l’energia cinetica in corrente elettrica. Sistema di controllo e di acquisizione del segnale Controlla l’introduzione del campione, le modalità di ionizzazione, i parametri di lavoro dell’analizzatore e registra il segnale acquisito dal rivelatore Sistema da vuoto Deve avere un’efficienza sufficiente a ridurre la pressione del campione in ingresso da 1 atm a quella richiesta nell’analizzatore.

25 Sistemi di introduzione del campione
Sistemi a carica (off line) Il campione viene volatilizzato termicamente ed inviato nella zona di ionizzazione. Sistemi a sonda Per solidi, liquidi non volatili e per campioni in piccole quantità Sistemi per iniezione diretta (o per FIA) Per inviare campioni liquidi ad interfacce a flusso (es. elettrospray) Sistemi cromatografici (GC, LC), CE. Interfaccia online con sistemi a flusso

26 Interfacciamento GC/MS
Stato del campione Sorgente Gassoso Ionizzazione elettronica (EI) Ionizzazione chimica (CI) Queste sorgenti sono adatte all’interfacciamento con la gascromatografia, purché il flusso di fase mobile sia compatibile con la MS GC con colonne impaccate: ~ 20 cm3 min-1 GC con colonne capillari: ~ 1 cm3 min-1 (accettabile per la MS)

27 GC/MS a iniezione diretta
Colonna GC capillare all’analizzatore di massa Lenti Camera di ionizzazione Colonna GC capillare: d ~ 250 µm L ~ 25 m F ~ 1-2 cm3 min-1

28 GC/MS con iniettore jet-orifice
Si basa sulla diversa direzione in cui nebulizzano molecole di massa atomica diversa. Il gas di trasporto (di solito He) diffonde più rapidamente dell’analita, che viene quindi arricchito. vuoto Sorgente ionica all’analizzatore di massa GC apertura di ~ 50 µm

29 GC/MS open-split con gas di spurgo
Un flusso di gas (He) impedisce all’analita eluito di ossidarsi a contatto con l’aria (O2) Vantaggio: facile cambiare la colonna Svantaggio: non arricchisce il campione

30 Schema di uno spettrometro di massa
Computer Segnale Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Rivelatore Campione (gassoso) Ioni Ioni torr Campione Sistema di vuoto

31 Per GC: Impatto elettronico (EI) Ionizzazione chimica (CI)
Sorgenti ioniche Per GC: Impatto elettronico (EI) Ionizzazione chimica (CI) Per LC: Elettrospray – nanospray APCI (atmospheric pressure chemical ionization) APPI (atmospheric pressure photoionization) MALDI (off line)

32 Classificazione delle sorgenti ioniche
Sorgenti “dure” (elevata frammentazione) Impatto elettronico Sorgenti “molli” (bassa frammentazione) Ionizzazione chimica Desorbimento (MALDI, elettrospray) Fotoionizzazione

33 Sorgente di ionizzazione elettronica
Fenditura di prima accelerazione Fenditura di focalizzazione Riscaldatore e catodo Flusso di molecole in ingresso Fenditura di prima accelerazione Riflettore All’analizzatore di massa Anodo Regione di ionizzazione Regione di accelerazione degli ioni (ddp = V) Vuoto

34 Meccanismo di ionizzazione per EI
Un fascio di elettroni viene generato da un filamento riscaldato di W o Re ed accelerato da una d.d.p. di ~70V. Il fascio di elettroni investe il fascio di molecole del campione a 90°. I prodotti primari dell’interazione fra elettroni e molecole (“collisione”) sono ioni positivi a carica unitaria (ioni molecolari, M+), che si formano per repulsione elettrostatica: M + e-  M•+ + 2e- M•+ è uno ione radicale. Siccome per ionizzare una molecola organica sono sufficienti circa 10 eV, l’eccesso di energia viene trasferito alla molecola e provoca la frammentazione.

35 Spettro di massa di frammentazione
Lo spettro di massa Spettro di massa di frammentazione 43 29 57 72 Spettro semplificato del pentano CH3 CH2 CH2 CH2 CH3

36 Sorgente per EI/CI Si impiega la stessa strumentazione della EI, con lievi modifiche. Le molecole del campione vengono ionizzate per collisione con gli ioni di un gas reagente, a sua volta ionizzato per EI. La zona di ionizzazione chimica viene tenuta ad una pressione maggiore (~ 60 Pa) per rendere abbastanza frequenti gli urti fra molecole dell’analita e ioni primari generati in sorgente.

37 Meccanismo di ionizzazione chimica
Le molecole del campione vengono ionizzate per collisione con gli ioni di un gas reagente, ionizzato per impatto elettronico. È possibile generare anche ioni negativi per cattura di elettroni “lenti”. Si impiega la strumentazione della EI, opportunamente modificata. Nella zona di ionizzazione il gas reagente viene mantenuto alla pressione di circa 1 torr. Il gas impiegato più comunemente è CH4: CH4 + e-  CH4•+ + 2e- EI del gas di ionizzazione CH4•+ + CH4  CH5+ + CH3• Trasferimento di un protone CH3+ + CH4  C2H5+ + H2 Reazioni ione-molecola CH5+ + XH  XH2+ + CH4 C2H5+ + XH  XH2+ + C2H4 C2H5+ + XH  X+ + C2H6 Lo ione generato può avere massa M+1, M+2, M-1 o anche M+29 (+C2H5).

38 Sorgenti ioniche Stato del campione Sorgenti a flusso
Liquido Elettrospray – nanospray APCI (atmospheric pressure chemical ionization) APPI (atmospheric pressure photoionization) LC: flussi ~ 0.1 – 1 cm3 min-1. Se l’eluente è acqua, 0.1 cm3 min-1 = 5.6 mmol min-1 = 135 cm3 min-1 (c.n.) Nano-HPLC: flussi ~ 10-4 cm3 min-1  0.1 cm3 min (c.n.)

39 Meccanismo fisico dell’elettrospray
L’applicazione di un potenziale elettrico ad alto voltaggio ad una goccia di liquido ne provoca la frammentazione in goccioline fini. La causa e’ la repulsione elettrostatica tra le cariche che si generano nella goccia.

40 Cono di Taylor Cono di Taylor Punta dell’ago

41 Ago cavo per elettrospray
Gas di trasporto Gocce di circa 1 µm Gas di desolvatazione Liquido di trasporto Campione Cono di Taylor Capillare riscaldato + - 2-6 kV

42 Nanospray con geometria “a Z”
Accoppiamento nanoHPLC-MS

43 L’elettrospray genera spettri multicarica
m/z La carica degli ioni è dovuta agli ioni metallici (es Na+) o ai protoni associati alla molecola. Gli addotti carichi sono quindi della forma: (M + H)+, (M + 2H)2+, …, (M + nH)n+

44 Ionizzazione chimica a pressione atmosferica
LC-APCI/MS

45 Ionizzazione chimica a pressione atmosferica
Sorgente ionica analoga alla CI, in cui la ionizzazione avviene per reazioni ione-molecola a pressione atmosferica Gli ioni primari vengono generati a pressione atmosferica mediante scariche a corona nel solvente nebulizzato o mediante emissione β-. Si applica a molecole ioniche o polari, di massa molare fino a circa 1500. Può funzionare sia in modalità positiva che negativa genera prevalentemente ioni monocarica.

46 ESI vs APCI - Sensibilità
Sensibilità relativa Flusso (µL/min) La ESI è sensibile alla concentrazione dell’analita, la APCI alla sua quantità. Per questo la ESI si presta ad essere accoppiata alla micro e nano HPLC.

47 Sorgente ionica a fotoionizzazione
                                             

48 Sorgente ionica a fotoionizzazione
Sorgente ionica a pressione atmosferica (APPI) di recente introduzione Una lampada UV a Kr emette fotoni di energia ~ 10 eV. L’energia dei fotoni è tale da ionizzare selettivamente un’ampia classe di molecole organiche, senza ionizzare il solvente. È adatta a molecole piccole e poco polari, che sono difficilmente ionizzabili con altri metodi. È una sorgente estremamente soft, e rappresenta un’alternativa alla APCI e alla ESI per la ionizzazione a pressione atmosferica.

49 Applicabilità delle sorgenti API

50 Schema di uno spettrometro di massa
Computer Segnale Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Rivelatore Campione (gassoso) Ioni Ioni torr Campione Sistema di vuoto

51 Caratteristiche di un analizzatore di massa
Intervallo di m/z : indica i valori minimo e massimo di m/z degli ioni che l’analizzatore è in grado di selezionare (determina l’applicabilità per un certo problema analitico). Potere risolutivo: indica la capacità di un analizzatore di distinguere due ioni con rapporti m/z simili tra loro (determina le prestazioni nell’analisi qualitativa). Efficienza di trasmissione: percentuale degli ioni selezionati che raggiungono il rivelatore dopo avere attraversato l’analizzatore, senza venire dispersi (determina le prestazioni nell’analisi quantitativa).

52 Risoluzione La capacità di uno spettrometro di massa di differenziare le masse è generalmente espressa dalla risoluzione R definita come: R = m/Δm dove Δm è la differenza di massa tra due picchi adiacenti risolti e m è la massa nominale del primo picco (o la media delle masse dei due picchi). Due picchi sono considerati risolti se l’altezza della valle tra di essi è inferiore ad una certa percentuale dell’altezza del picco meno intenso (di solito il 10%). Uno spettrometro con una risoluzione di risolverà due picchi con valori di m/z 400,0 e 400,1 (o di 40,00 e 40,01). Gli spettrometri commerciali hanno R che variano circa tra 500 e

53 Classi di analizzatori di massa
A settore magnetico A doppia focalizzazione A quadrupolo (lineare) Trappola ionica a quadrupolo A tempo di volo

54 Analizzatore a settore magnetico
Spettrometro di massa a focalizzazione semplice Di solito la sorgente è a EI o CI 60, 90 o 180° 1 2 B Schermo metallico + Lo spettro si registra facendo una scansione di V o di B. La scansione di V permette di usare magneti permanenti per la generazione del campo B. Normalmente gli strumenti commerciali sono a scansione di V. m, z V Ioni più pesanti 10-7 torr Ioni più leggeri Rivelatore R < 2000, perché gli ioni entrano nel settore magnetico con una distribuzione di energie cinetiche, e quindi di velocità.

55 Analizzatore elettrostatico
Energia cinetica 1 2 Forza centripeta + + E m, z V r - Per potere attraversare la fenditura, gli ioni devono avere una determinata velocità. L’analizzatore elettrostatico non è un analizzatore di massa, ma un filtro di velocità, per cui viene utilizzato in combinazione con un analizzatore di massa per aumentarne la risoluzione.

56 Doppia focalizzazione
Spettrometro di Nier-Jonson Piano focale delle energie Punto di doppia focalizzazione (Rivelatore) Piano focale delle velocità – m/z + + – – + Campo elettrico Campo magnetico Risoluzioni (m/Δm) fino a al 10% dell’altezza di picco)

57 Analizzatore di massa a quadrupolo
Potenziale nel quadrupolo

58 Campo “a sella” del quadrupolo
Al centro del quadrupolo lo ione si trova in un potenziale elettrico a sella, che ruota alla frequenza del campo a RF. L’energia dello ione viene continuamente convertita da cinetica a potenziale e viceversa. Lo ione assume quindi un moto oscillatorio attorno alla posizione di equilibrio (sull’asse del quadrupolo), con una frequenza ed un ampiezza di oscillazione che dipendono dalla frequenza e ampiezza del campo, dalla massa e dalla carica dello ione.

59 Traiettorie dello ione
piano xz Traiettoria instabile lungo x, stabile lungo y piano yz piano xz piano yz Traiettoria stabile sia lungo x che lungo y

60 Analizzatore di massa a quadrupolo
Massimo valore m/z ~ 4 000 Risoluzione ~ 3 000 I quadrupoli sono strumenti a bassa risoluzione Si lavora normalmente alla risoluzione di una unità di massa. Leggero, di dimensioni contenute Facile da accoppiare alla cromatografia Efficiente trasmissione degli ioni Necessaria una elevata precisione nell’allineamento delle barre degli elettrodi

61 Classi di analizzatori di massa
A settore magnetico A doppia focalizzazione A quadrupolo (lineare) Trappola ionica a quadrupolo A tempo di volo

62 Trappola ionica a quadrupolo
Processore di scansione Generatore di RF Rivelatore Generatore supplementare di RF Elettrodo a calotta (end-cap) Elettrodo ad anello Filamento

63 Traiettorie ioniche nella trappola a quadrupolo
Moto degli ioni in direzione z Moto degli ioni in direzione r tempo Gli ioni vengono intrappolati forzandoli su traiettorie chiuse stabili all’interno della trappola. Quando la traiettoria di uno ione diventa instabile, questo esce dalla trappola e viene rivelato.

64 Classi di analizzatori di massa
A settore magnetico A doppia focalizzazione A quadrupolo (lineare) Trappola ionica a quadrupolo A tempo di volo

65 Analizzatore a tempo di volo (TOF)
Zona di accelerazione con campo elettrostatico E Ioni positivi Sorgente d V = 0 dE = V0 = V V = V0 L

66 API – QqTOF MS/MS Ottica di trasferimento Cono di campionamento
Quadrupolo (ponte ionico) Esapolo (ponte ionico)

67 Analizzatore di massa a tempo di volo
Massimo valore m/z > Risoluzione fino a – Il reflectron consente di: Ridurre le dimensioni Aumentare la risoluzione Ideale accoppiamento con sorgenti pulsate Efficiente trasmissione degli ioni

68 Schema di uno spettrometro di massa
Computer Segnale Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Rivelatore Campione (gassoso) Ioni Ioni torr Campione Sistema di vuoto

69 Rivelatori a scintillazione Moltiplicatori di elettroni
Rivelatori di ioni Lastre fotografiche Ad AgBr. Sono state i primi rivelatori di ioni Coppa di Faraday Un semplice elettrodo collettore schermato Economico, poco sensibile Rivelatori a scintillazione A cristalli di materiale fosforescente Moltiplicatori di elettroni A dinodi separati A dinodo continuo

70 Doppia spettrometria di massa (MS/MS)
Ionizzazione e frammentazione analisi di massa m/z decomposizione m1

71 Applicazioni della MS/MS
Maggior contenuto di informazioni Studio della struttura Informazioni addizionali per determinare la struttura di uno ione Rivelazione selettiva di uno ione Drastica riduzione delle interferenze Studio delle reazioni ione-molecola

72 Tandem MS - nomenclatura
Corrente ionica totale (total ion current, TIC) 1. (dopo l’analisi di massa): La somma di tutte le correnti ioniche trasportate dagli ioni che contribuiscono allo spettro di massa (detta anche corrente ionica ricostruita). È la somma di tutte le correnti di monitoraggio di ioni singoli (single ion monitoring, SIM) 2. (prima dell’analisi di massa): La somma di tutte le correnti ioniche relative a ioni dello stesso segno, prima dell’analizzatore di massa (il rivelatore è posto tra la sorgente e l’analizzatore di massa).

73 Tandem MS - nomenclatura
Ione molecolare: ione formato per addizione o rimozione di uno o più elettroni dalla molecola dell’analita. Per definizione è lo ione che contiene l’isotopo più abbondante di tutti gli elementi coinvolti (per ragioni statistiche, non sempre dà il picco più intenso). Ione addotto: ione formato dall’interazione di due specie, contenente tutti gli atomi di una di esse e uno o più atomi dell’altra. Ione pseudomolecolare: ione formato dalla molecola dell’analita per sottrazione di un protone (M – H)- o di uno ione idruro (M + H)+, o per formazione di un addotto con uno uno ione presente nel plasma di ionizzazione. Da questi ioni è possibile ricavare la massa molare dell’analita.

74 Tandem MS - nomenclatura
Ione precursore: (ione genitore) uno ione che subisce una decomposizione o una variazione di carica. Ione prodotto: (ione figlio) ione formato da una qualsiasi reazione dello ione precursore. Ione frammento: ione formato dalla frammentazione dello ione precursore. Perdita neutra: specie neutra formata dalla frammentazione di uno ione precursore. Spettro della sorgente: spettro ottenuto con un singolo analizzatore.

75 MS/MS nello spazio e nel tempo
Cella di collisione MS/MS nello spazio MS/MS nel tempo Tempo 1 Tempo 2 Tempo 3 Scansione dello ione prodotto Selezione m/z Scansione

76 Modalità di scansione MS/MS
Scansione dello ione prodotto Selezione m/z Scansione Scansione dello ione precursore Simbolismo alternativo Analizzatore di massa fisso Spettrometro di massa a scansione Scansione dello ione prodotto Scansione dello ione precursore Scansione di perdita neutra Monitoraggio di reazione selezionata Scansione Selezione m/z Scansione di perdita neutra Scansione m/z = x Scansione m/z = x-a Monitoraggio di reazione selezionata Selezione del precursore m/z = a Selezione del frammento m/z = b

77 Modalità di scansione MS/MS
Scansione dello ione prodotto: consiste nel selezionare uno ione precursore, di m/z fissato, e nella determinazione di tutti gli ioni prodotti dalla frammentazione attivata per collisione (CID). Se nella cella di collisione si usa un gas reagente, si osservano i prodotti di reazione attivate per collisione (CAR). Quando vengono prodotti solo ioni frammento, questa modalità di scansione è detta anche scansione di ioni frammento. Scansione dello ione precursore: consiste nello scegliere uno ione prodotto e nel determinare gli ioni precursori. Permette di identificare gli ioni precursori di un certo frammento. Questa modalità di scansione, che non si può realizzare con la in time MS/MS, richiede la focalizzazione del secondo analizzatore su di uno ione selezionato, e la scansione di massa sul primo analizzatore. Vengono rivelati gli ioni precursori che per reazione o frammentazione producono ioni figlio della massa selezionata.

78 Modalità di scansione MS/MS
Scansione di perdita neutra (NLS): consiste nello scegliere un frammento neutro e nel rivelare tutte le frammentazioni che portano alla perdita di tale frammento. Come nel caso della scansione dello ione precursore, questa modalità non è realizzabile in MS/MS nel tempo. La scansione richiede che entrambi gli analizzatori scandiscano contemporaneamente, ma con una differenza di massa fissa a fra di loro. Quando uno ione di massa m attraversa il primo analizzatore, viene rivelato solo se produce un frammento di massa m – a. Monitoraggio di reazioni selezionate (SRM): consiste nel selezionare una reazione di frammentazione. In questa modalità, entrambi gli analizzatori sono focalizzati su masse selezionate. Non si ha quindi scansione. È analogo al “monitoraggio di ioni selezionati” in spettrometria di massa singola, ma in questo caso gli ioni selezionati dal primo analizzatore danno un segnale solo se producono un certo frammento mediante una certa reazione. L’assenza di scansione permette di aumentare la sensibilità, oltre che la selettività.

79 Combinazioni strumentali per MS/MS
MS/MS nello spazio Settori elettrico-magnetico: EB/EB o BE/BE (max MS4). Triplo quadrupolo: QqQ Tempo di volo lineare/reflectron: TOF/TOF. Combinati: EBqQ QqTOF MS/MS nel tempo (MSn) Trappola ionica a quadrupolo (max MS8) Risonanza ciclotronica (ICR FTMS) Combinati: Qq(trap) MSn nello spazio e/o nel tempo

80 Analisi qualitativa Criteri stabiliti dalla CE per la prevenzione dei falsi positivi Il sistema prevede un punteggio per ogni identificazione, e sono richiesti 3 punti per confermare un risultato positivo. Inoltre, le intensità relative degli ioni registrati non devono scostarsi più del 20% rispetto a quelle ottenute da uno standard, e i tempi di ritenzione di non più del 2.5%.

81 Analisi quantitativa Confronto fra le sensibilità di diverse modalità di MS e MS-MS. Analisi di naftalene-1,5-disolfonato in ESI-

82 GC-QMS di ormoni steroidei
acido nonilfenossietossiacetico nonilfenolo dietossilato acido nonilfenossiacetico nonilfenolo monoetossilato nonilfenolo Cromatogramma ottenuto dall’analisi “spazio di testa-SPME-GC-MS” di un campione di acqua di fiume in entrata ad un depuratore. Condizioni sperimentali: colonna GC: BD-5MS, 30mx0,25 mm I.D., spessore del film: 0,25μm. Analizzatore di massa: singolo quadrupolo operante in modalità SIM.

83 GC-MS con iniezione “purge and trap” (PTI)
Diagramma a blocchi del sistema per l’analisi on-line PTI-GC-MS di campioni di acqua e neve.

84 Sistema di iniezione PTI
STEP 1 STEP 2 Sistema di introduzione del campione “Purge and Trap”. Step 1: caricamento del campione. Step 2: fase di estrazione (purge). (a) contenitore di vetro, (b) ago fisso, (c) tubicino collegato all’ago che termina sul fondo del contenitore, usato per l’introduzione e la rimozione del campione (d) setto poroso.

85 Analisi di idrocarburi alogenati
Cromatogramma di un campione di acqua di rete ottenuto mediante PTI-GC-MS, operante in modalità SIM. 1) cloroformio; 2) 1,1,1-tricloroetano; 3) tetraclorometano; 4) 1,1,2-tricloroetilene; 5) bromodiclorometano; 6) dibromoclorometano; 7) tetracloroetilene; 8) bromoformio. Volume del campione 10 mL; tempo di purge 10 min; temperatura della trappola per l’umidità -10°C; temperatura della trappola fredda -100°C; temperatura del forno: temperatura iniziale 10°C, tempo iniziale 1,50 min; gradiente 40°C/min, temperatura finale 120°C, tempo finale 1,25 min.

86 Fast GC-MS Confronto tra cromatogrammi acquisiti rispettivamente a 500 e 50 spettri per secondo. Condizioni sperimentali: colonna capillare: OV-1, 0,3mX50μm I.D., 0,17 df. Analizzatore di massa: TOF, operante nell’intervallo di m/z Composti: 1) pentano, 2) 2,3-dimetilbutano, 3) esano, 4) benzene, 5) eptano, 6) metilcicloesano, 7) toluene, 8) ottano.

87 Tecniche separative per classi di composti
Correlazione tra le proprietà dell’analita e la tecnica separativa più appropriata.

88 MS per classi di composti
Correlazione tra le proprietà dell’analita e la modalità di ionizzazione a pressione atmosferica più appropriata

89 LC/MS di composti fortemente acidi
Spettro ESI+ di una soluzione di Na2EDTA in presenza di vari metalli. La miscela può essere preventivamente separata in cromatografia ionica per ridurre eventuali interferenze.

90 LC/MS di acidi deboli Trigalloil glucosio Digalloil glucosio
Monogalloil glucosio Acido elagico Acido gallico Cromatogrammi e transizioni impiegate per la MRM di una miscela di tannini. La MRM permette di distinguere oligomeri non risolti cromatograficamente.

91 LC/MS di composti basici
Difenilstagno Dibutilstagno Trifenilstagno Tributilstagno 50 mg/L RPLC-APCI-MS di una miscela di composti di alchilstagno. La LC/MS permette l’identificazione dei composti, che saranno poi determinati con maggiore sensibilità in LC-ICP-MS 10 µg/L

92 Classi di inquinanti emergenti

93 Diffusione degli inquinanti emergenti
Frequenza di rivelazione (A) e percentuale rispetto alla concentrazione totale misurata (B) di contaminanti di acque di scarico facenti parte della categoria di uso generale. Il numero di composti per ogni categoria è riportato sopra la barra.

94 Metodi LC-MS per classi di composti
Rassegna dei metodi LC-MS impiegati nell’analisi quantitativa di farmaci per uso umano e veterinario

95 Metodi LC-MS per classi di composti

96 Metodi LC-MS per classi di composti

97 Metodi LC-MS per classi di composti

98 LC-MS-MS di ormoni steroidei
Spettri full-scan MS-MS ed ipotetiche strutture chimiche del precursore (riquadro a tratto continuo) e degli ioni prodotto (riquadro tratteggiato) ottenuti per infusione dell’estrone (sopra) e dell’estradiolo (sotto) in APCI(PI)-MS-MS.

99 LC-MS di antibiotici in campioni solidi
Cromatogrammi e corrispondenti spettri di massa tandem di tetracicline e clorotetracicline, ottenuti da un campione di terreno agricolo concimato con letame