Corso di Genomica a.a. 2010-2011 lezione 25-26 laurea magistrale Biotecnologia Industriale Martedì 11 Gennaio 2011 aula 6A orario : Martedì ore 14.00 -

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1 corso di Genomica a.a. 2010-2011 lezione 25-26 laurea magistrale Biotecnologia Industriale Martedì 11 Gennaio 2011 aula 6A orario : Martedì ore 14.00 - 16.00 Giovedì ore 13.00 - 15.00 D. Frezza Esami: 24 Febbraio, 3 Marzo, 23 Marzo

2 Espressione x staminalità 4 geni di staminalità Oct 3/4 (Pouf 5f1), Sox2, c-myc, Klf4 Fibroblasti trasfettati e selezionati per espressione di Fbxo15 cellule iPS = induced pluripotent (Fbx15iPS) Fenotipo come ES, proliferano e danno teratomi; Diverse per l’espressione del DNA e metilazione, non producono topi chimerici adulti iniettandole in blastocisti Nuovo esperimento: selezione delle iPS per l’espressione di Nanog

3 Espressione di Nanog Produzione di fenotipo germline-competent iPS aumento di espressione: di geni ES-cell-like e del pattern di metilazione rispetto alle Fbx15 iPS I 4 transgeni Oct3/4, Sox2, c-myc e Klf4 sono silenziati nei cloni di cellule Nanog iPS Sono stati ottenuti topi chimerici da 7 cloni Nanog iPS ed un clone è stato trasmesso nella generazione successiva di un topo transgenico Circa il 20% dei topi transgenici sviluppava tumori per la riattivazione di c-myc

4 riattivazione di c-myc c-myc transgenico genera rischio neoplastico nel 20% della progenie dei topi transgenici Cellule iPS competenti per avere topi chimerici “germline” e poi transgenici possono essere ottenute da fibroblasti Deve essere evitato l’uso della transgenesi c-myc per le applicazioni cliniche.

5 Il marker Nanog Mitsui K, Yamanaka S. et al. Embryonic stem (ES) cells derived from the inner cell mass (ICM) of blastocysts grow infinitely while maintaining pluripotency. Leukemia inhibitory factor (LIF) can maintain self-renewal of mouse ES cells through activation of Stat3. However, LIF/Stat3 is dispensable for maintenance of ICM and human ES cells, suggesting that the pathway is not fundamental for pluripotency. In search of a critical factor(s) that underlies pluripotency in both ICM and ES cells, we performed in silico differential display and identified several genes specifically expressed in mouse ES cells and preimplantation embryos. We found that one of them, encoding the homeoprotein Nanog, was capable of maintaining ES cell self-renewal independently of LIF/Stat3. nanog-deficient ICM failed to generate epiblast and only produced parietal endoderm-like cells. nanog- deficient ES cells lost pluripotency and differentiated into extraembryonic endoderm lineage. These data demonstrate that Nanog is a critical factor underlying pluripotency in both ICM and ES cells. Cell. 2003 May 30;113(5):631-42

6 Nanog sono LIF indipendenti Cellule LIF Stat 3 proliferano ma è dispensabile, Differential display experiments in silico hanno mostrato che l’omeogene Nanog mantiene la totipotenza -formazione della massa interna della blastocisti e staminalità - efficienza della riprogrammazione dopo fusione con cellule somatiche

7 Nanog promotes transfer of pluripotency after cell fusion Nature 2006 Jun 22;441:997-1001 Silva J, Chambers I, Pollard S, Smith A. Through cell fusion, embryonic stem (ES) cells can erase the developmental programming of differentiated cell nuclei and impose pluripotency. Molecules that mediate this conversion should be identifiable in ES cells. One candidate is the variant homeodomain protein Nanog, which has the capacity to entrain (~indurre) undifferentiated ES cell propagation. Here we report that in fusions between ES cells and neural stem (NS) cells, increased levels of Nanog stimulate pluripotent gene activation from the somatic cell genome and enable an up to 200-fold increase in the recovery of hybrid colonies, all of which show ES cell characteristics. Nanog also improves hybrid yield when thymocytes or fibroblasts are fused to ES cells; however, fewer colonies are obtained than from ES x NS cell fusions, consistent with a hierarchical susceptibility to reprogramming among somatic cell types. Notably, for NS x ES cell fusions elevated Nanog enables primary hybrids to develop into ES cell colonies with identical frequency to homotypic ES x ES fusion products. This means that in hybrids, increased Nanog is sufficient for the NS cell epigenome to be reset completely to a state of pluripotency. We conclude that Nanog can orchestrate ES cell machinery to instate pluripotency with an efficiency of up to 100% depending on the differentiation status of the somatic cell.

8 Selezione per Nanog cells Prova di selezione delle cellule che esprimono Nanog (omeogene) per ottenere cellule iPS (ind. pluripotent stem) - Isolamento di un Bac (bacterial artificial chromosome) ~200kb contenente Nanog - inserimento in ES di GFP, IRES-puromycin resistence gene cassette nel 5’UTR - cellule con l’espressione di GFP non inducibili al differenziamento - si ottengono topi chimerici GFP (+Nanog-IRES-Puro r ) - GFP si mantiene nella massa interna della blastocisti e solo in Primordial Germ Cells che migrano - dopo 13.5 gdc GFP nelle creste genitali-germinali

9 Isolamento di fibroblasti -Isolamento di fibroblasti embrionali (MEF) da cellule delle creste genitali, cervello e tessuti viscerali - solo 1% delle creste genitali esprime GFP vedi figura

10 Figura 1 ES

11 trasformazione di una linea SNL fibroblast feeder layers support derivation and maintenance of human induced pluripotent stem cells. Pan C, Hicks A, Guan X, Chen H, Bishop CE. College of Animal Science and Technology, Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture, Northwest A & F University, Yangling 712100, China. Abstract Induced pluripotent stem (iPS) cells can be derived from human somatic cells by cellular reprogramming. This technology provides a potential source of non- controversial therapeutic cells for tissue repair, drug discovery, and opportunities for studying the molecular basis of human disease. Normally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) are used as feeder layers in the initial derivation of iPS lines. The purpose of this study was to determine whether SNL fibroblasts can be used to support the growth of human iPS cells reprogrammed from somatic cells using lentiviral expressed reprogramming factors. In our study, iPS cells expressed common pluripotency markers, displayed human embryonic stem cells (hESCs) morphology and unmethylated promoters of NANOG and OCT4. These data demonstrate that SNL feeder cells can support the derivation and maintenance of human iPS cells. J Genet Genomics. 2010 Apr;37(4):241-8.

12 trasformazione con retrovirus Fibroblasti Nanog-GFP-IRES-Puro r MEFs coltivate su feeder SNL (Neo G418 resistente) -trasformazione con retrovirus con Oct3/4, Sox2, Klf4 ed il mutante di c-myc (T58A) - selezione per la resistenza alla puromicina dopo 3, 5, 7 giorni dalla infezione col retrovirus - si ottengono più cellule GFP aumentando la conc di purom. -trasformazione con combinazioni di 3 geni su 4 non erano sufficienti a dare cellule GFP - trapianto sottocutaneo di queste cellule produceva tumori di tessuti diversi derivati dai tre foglietti: dimostrazione della totipotenza