pSC101 was the first E. coli cloning vector, used in 1973 by Herbert Boyer and Stanley Norman Cohen. They demonstrated that a gene from a frog.

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5 pSC101 was the first E. coli cloning vector, used in 1973 by Herbert Boyer and Stanley Norman Cohen. They demonstrated that a gene from a frog could be transferred into bacterial cells and then expressed by the bacterial cells. pBR322 was one of the first widely used E. coli cloning vectors. Created in 1977 in the laboratory of Herbert Boyer at the University of California, San Francisco. BR is for "Bolivar" and "Rodriguez.“, the two Mexican postdoc who constructed it.

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8 Cloramfenicolo acetil tranferasi (Cat)

9 Tre tipi di resistenza: export della tetraciclina dalla cellula, protezione ribosomiale, modificazione della tetraciclina

10 Produzione di fosfotransferasi determina resistenza fosforilando kanamicina in posizione 3’ sfruttando ATP.

11 Identificazione delle molecole di DNA ricombinanti
Un generale principio su cui si basa questa identificazione è la “insertional inactivation”

12 Insertional inactivation of an antibiotic resistance gene

13 Insertional inactivation non sempre coinvolge resistenza agli antibiotici: “Lac selection”
b-galattosidasi rompe la molecola di lattosio in glucosio + galattosio Si usa un analogo del lattosio: 5-bromo-4-cloro-3-indolil- b-D-galattopiranoside (X-gal) IPTG: isopropil-tiogalactopiranoside

14 Lattosio X-gal

15 TERRENI SINTETICI (composizione definita); Soluzione tampone (fosfato)
Fonte di N salina Fonte di C definita (glucosio, glicerolo, altri zuccheri) Oligoelementi/richieste nutrizionali SEMISINTETICI (composizione parzialmente definita) Estratto di lievito/peptoni di origine animale o vegetale RICCHI (composizione non definita, LB eYT): Estratto di lievito Peptoni di origine animale o vegetale Fonti di C aggiuntive (glicerolo, zuccheri puri o in miscele) Magnesio Tryptone is the assortment of peptides formed by the digestion of casein by the protease trypsin.

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17 Trasformazione in E. coli
 Trasformazione in DH5 (propagano velocemente il plasmide)  A l di cellule competenti di E.coli (DH5) si aggiungono 5.0 l di ciascuna delle reazioni di ligasi. 30’, ghiaccio 90’’, 42°C 2’, ghiaccio Aggiungere l 2xYT, 1h shaker a 37°C, 150 rpm. Strisciare su piastre contenenti 2 x YT + amp (200 g/ml), 200.0 l e l di ognuna delle trasformazioni. O/N, 37°C 2  YT l Triptone g (ottenuto dalla idrolisi enzimatica della caseina) estratto di lievito g NaCl g Portare a volume con H2O – Sterilizzare in autoclave, 120 °C, 1 bar, 30’.

18 Preparazione piastre Le piastre vengono preparate con un terreno che contiene: 1) i nutrienti per la crescita del batterio (LB, YT, M9) 2) agar-agar per gelificare (polisaccaride naturale ricavato da alghe rosse) 3) antibiotico L’antibiotico serve per selezionare le colonie in cui e’ presente il plasmide. Infatti il gene per la resistenza all’antibiotico, se presente, è sul plasmide che contiene anche il gene strutturale della proteina d’interesse 2  YT agar 0.5 l triptone g estratto di lievito g NaCl g Agar-agar g Portare a volume con H2O – Sterilizzare in autoclave, 120 °C, 1 bar, 30’. Aggiungere soluzione ampicillina sterile (concentrazione finale 200 g/ ml, 0.5 ml aggiunti in 0.5 l) quando la soluzione e’ quasi fredda, prima che solidifichi. Principali Antibiotici Conc. ampicilllina g/ml cloramfenicolo g/ml canamicina 50 g/ml streptomicina 50 g/ml tetraciclina 50 g/ml

19 Screening delle colonie
Reazione Reazione di controllo La reazione di controllo non contiene il gene, ma solo il vettore. Se il vettore è stato correttamente tagliato e defosforilato questo non può chiudersi su se stesso e quindi non deve essere in grado di sviluppare la resistenza all’antibiotico presente sulla piastra Sulla piastra di controllo non dovrebbe crescere nessuna colonia Se è presente qualche colonia questa è dovuta alla presenza di background E’ opportuno selezionare alcune delle colonie sulla piastra positiva, per verificare la presenza del gene

20 Screening delle colonie
Con un’ansa sterile si prelevano singole colonie. Ciascuna di queste, viene inoculata, in condizioni di sterilità, in un tubo da coltura contenente 5 ml di terreno liquido (2 xYT + amp (200 g/ml) Le colture vengono cresciute O/N, sotto agitazione, a 37 °C fino al raggiungimento della fase stazionaria (12-16 ore) fase stazionaria OD600 fase esponenziale 4 8 12 16 tempo di incubazione

21 Lisi cellule batteriche per isolare il DNA plasmidico
 Le cellule batteriche vengono raccolte per centrifugazione e poi lisate per isolare il plasmide  La lisi delle cellule per isolare il DNA può essere ottenuta per trattamento con: solventi organici alcali riscaldamento detergenti  Detergente lisa la cellula batterica, il trattamento con alcali distrugge l’appaiamento tra le basi  L’acetato di potassio riporta la soluzione a pH neutro e fa precipitare i lipidi e le proteine più grandi. Il DNA cromosomiale lineare si denatura irreversibilmente e viene intrappolato nel precipitato, mentre i plasmidi rinaturati rimangono in soluzione  La centrifugazione separa il DNA plasmidico dal precipitato  Da ogni coltura verrà isolato il DNA plasmidico con il QIAprep Spin Miniprep kit: Le cellule vengono lisate per trattamento con SDS e alcali. L’estratto viene neutralizzato, portato ad alta forza ionica, assorbito su membrana, ed eluito con bassa forza ionica.

22 Protocollo di isolamento del DNA plasmidico
50 mM Tris-HCl 10 mM EDTA 100 g/ml RNase P2: 200 mM NaOH 1% SDS N3: 3.0 M CH3COOK

23 Protocollo di isolamento del DNA plasmidico

24 PCR screening  La presenza del gene nel vettore di espressione viene verificata amplificando un tratto del vettore contenente il gene, da ciascuno dei campioni isolati vettore di espressione gene  Si utilizzano 2 primers, uno che si appaia al gene e uno al vettore esternamente al gene.  Dopo amplificazione via PCR, se il gene è correttamente inserito nel vettore si deve identificare un frammento corrispondente al numero di basi comprese tra i 2 primers  Un metodo alternativo è quello di “digerire” il plasmide con opportuni enzimi di restrizione e verificare la lunghezza dei frammenti ottenuti

25 PCR screening Per gli n campioni di DNA preparare un miscela di reazione (Master Mix) così composta H2O sterile x (n+1) l Buffer per Taq (10 x) x (n+1) l dNTPmix (10 mM tot, 200 M ognuno fin) x (n+1) l Primer SODfor (100 pmol/l) x (n+1) l Primer SODSal I (100 pmol/l) x (n+1) l Taq polimerasi 5 U/ x (n+1) l In eppendorf aliquotare 22.0 l di Master Mix. Aggiungere a ciascuno 3.0 l di DNA plasmidico estratto dalle colture.  Cicli 94 °C 5’ 94 °C 30’’ 41 °C 30’’ 30 cicli 72 °C 1’ 72 °C 10’ 15 °C O/N Caricare 5.0 l di ciascuna reazione l loading buffer su un gel di agarosio al 2%  Aggiungere come ultimo campione 1.0 l marker 100 bp l H2O l loading buffer.  Verificare dal gel che i frammenti amplificati abbiano la lunghezza aspettata (500 bp).

26 Determinazione spettrofotometrica della conc. di DNA
Misurare allo spettrofotometro la concentrazione dei campioni di DNA isolati che hanno dato risultato positivo allo screening via PCR. Fare il bianco a 260 nm con l di H2O in una cuvetta da 1 ml Aggiungere 2.0 l di campione. A260 = 1 corrisponde circa a 50 g/ml DNA a doppia elica Aobs : 1 = X : 50 g/ml X = (Aobs x 50)= concentrazione DNA in cuvetta