La Cromatografia La cromatografia é una tecnica di separazione di vari componenti di una miscela che consiste nello sfruttare in modo particolarmente.

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1 La Cromatografia La cromatografia é una tecnica di separazione di vari componenti di una miscela che consiste nello sfruttare in modo particolarmente efficiente la diversa attitudine che ogni molecola o ione possiede nel distribuirsi tra due differenti fasi (una stazionaria e una mobile) I componenti della miscela sono separati in funzione delle diverse velocità con cui sono trasportati attraverso la fase stazionaria dalle fase mobile nasce dalla separazione dei vari pigmenti di una miscela di clorofille utilizzando una colonna impaccata con carbonato di calcio, ed eluita con etere di petrolio, che diedero luogo alla formazione di strati di diverso colore (da cui il nome:'cromos'-colore).

2 La Cromatografia La fase stazionaria può essere costituita da:
un solido un liquido opportunamente supportato. La fase mobile é costituita da un fluido (che si muove sopra la fase stazionaria), cioè da: un liquido un gas. I metodi cromatografici si distinguono in: Cromatografia su colonna in cui la fase stazionaria è contenuta in una colonna tubolare e la fase mobile passa attraverso di essa Cromatografia planare in cui la fase stazionaria e depositata su di una superficie piana e la fase mobile migra su di essa per capillarità

3 I coefficienti di Distribuzione
Consideriamo un sistema formato da due fasi in cui viene introdotta una sostanza: la sostanza si distribuirà fra le due fasi a seconda delle sue particolari proprietà chimico-fisiche Indicando con Cm e Cs le sue concentrazioni nella fase mobile e nella fase stazionaria rispettivamente, si istaureranno istantaneamente equilibri di ripartizione del tipo: con K la corrispondente costante di equilibrio ( o costante di distribuzione): K = Cs / Cm E’ dal valore di K che dipende il tempo di ritenzione, cioè il tempo che occorre per percorrere l’intera fase stazionaria: un’elevata concentrazione nella fase stazionaria, rispetto a quella nella fase mobile, indica una maggiore affinità per la prima. Altre sostanze, relativamente più affini alla fase mobile e meno verso la fase stazionaria, verranno più facilmente dislocate dalle posizioni che occupano e trasportate cosi verso la fine della colonna, separandosi sempre di più dalle sostanze maggiormente trattenute.

4 I coefficienti di Distribuzione

5 Separazione Cromatografica
Immaginiamo di avere una colonna mpaccata di una fase stazionaria porosa e di seinare la miscela di a e b in testa, osserviamo la migrazione al passaggio della fase mobile.

6 I Meccanismi di Separazione Cromatografica

7 I Meccanismi di Separazione Cromatografica

8 La Cromatografia Planare : TLC
La TLC (Thin Layer Chromatography) è una tecnica cromatografica in cui la fase stazionaria è costituita da un solido poroso polare come silice (acida) o allumina (basica) depositata su di uno strato di alluminio o vetro; La fase eluente è costituita da una miscela di solventi organici apolari che migrano lungo la lastra cromatografica per capillarità La miscela da separare è adsorbita o seminata alla base della lastra ed immersa nella fase mobile in una camera di sviluppo

9 TLC La camera di eluizione è un contenitore ermeticamente chiuso nel quale si crea un equilibrio tra la fase liquida e quella di vapore, da cui la fase mobile trae la spinta per la sua migrazione I componenti del campione vengono separati sulla fase stazionaria dipendentemente da quanto fortemente essi vi rimangono assorbiti rispetto a quanto si sciolgono nella fase eluente.

10 Il Fattore di Ritardo Rf
Linea di fronte Linea di semina Il fattore Rf è tipico di ciascuna sostanza a parità di fase stazionaria ed eluente utilizzata e dunque può essere utilizzato come parametro per l’analisi qualitativa di miscele.

11 Seguire una reazione chimica mediante tlc

12 La Rivelazione Rivelazione Cromatica
quando le sostanze da separare assorbono nel visibile, la rivelazione è immediatamente osservabile ad occhio nudo Rivelazione con luce UV Se le sostanze da rivelare possiedono cromofori derivanti da particolari gruppi funzionali quali doppi legami coniugati, carbonili, carbossili, ecc… è sufficiente illuminare la lastrina con una lampada UV che emetta a 254 e 366 nm; si osservano così delle macchie luminose sul fondo scuro. Se invece le sostanze da rivelare non possiedono cromofori, si può usare una lastra la cui fase stazionaria, prima o dopo l’eluizione, viene impregnate di una sostanza fluorescente ai raggi UV. Illuminando la lastra con le apposite lampade, si osservano delle macchie scure su sfondo fluorescente Rivelazione con reagenti chimici Questi reagenti, vaporizzati sulle sostanze eluite, formano con esse composti colorati.

13 La Cromatografia su Colonna
Nella cromatografia su colonna la fase stazionaria è contenuta in una colonna tubolare. A seconda della natura della fase stazionaria la cromatografia su colonna può sfruttare metodi di adsorbimento, ripartizione, scambio ionico o esclusione per separare i componenti della miscela. Si distinguono i seguenti metodi: Cromatografia su colonna a bassa pressione (LPC). La fase mobile è un liquido organico a bassa viscosità mentre le fasi stazionarie, solide, liquide o gel, possono avere caratteristiche chimico-fisiche molto variabili. La tecnica prevede la deposizione in testa ad una colonna (impaccata con un’opportuna fase fissa) di una certa quantità di miscela da separare. Facendo scorrere l’eluente lungo questa colonna si ottiene una certa distribuzione dei componenti della miscela lungo la fase stazionaria Cromatografia in fase liquida ad elevate prestazioni (HPLC) che consiste nella versione strumentale della cromatografia su colonna. L'eluente viene fatto fluire ad alta pressione e le sostanze in uscita vengono rilevate strumentalmente con opportuni dispositivi. Gas-Cromatografia (GC), in cui la fase mobile è un gas

14 Il Cromatogramma C t (min)
Con il procedere della separazione, le sostanze usciranno dalla colonna dopo il passaggio di un certo tempo (tempo di ritenzione) durante il quale è fluito un certo volume di solvente (volume di ritenzione). Il soluto migra sulla colonna trascinato dall’eluente. Le differenze di velocità tra le singole molecole dovute a fattori di diffusione fanno sì che tutte le molecole di un certo soluto escano dalla colonna distribuite in un “range” di tempo, registrato come una banda. Il cromatogramma riporta le concentrazioni di sostanza in uscita in funzione del tempo o del volume di eluente

15 I Parametri Sperimentali
tempo di ritenzione è il tempo impiegato tra l’iniezione del campione e la registrazione del massimo del picco; dipende dalla natura della sostanza, dalla colonna e dalle condizioni operative; è fondamentale per le analisi qualitative. area del picco è la superficie delimitata dal contorno del picco e la linea di base; dipende dalla quantità di sostanza in uscita e dalle caratteristiche del rivelatore; è fondamentale per le analisi quantitative.

16 I Parametri Sperimentali
fattore di ritenzione k E’ il rapporto tra le moli di soluto che rimangono istantaneamente legate sulla fase stazionaria e quelle istantaneamente disciolte nella fase mobile: È legato alla velocità lineare con cui un soluto attraversa la colonna: l’attraversamento del soluto è infatti possibile solo attraverso il flusso della fase mobile in cui esso si scioglie. La velocità con cui un soluto attraversa la colonna è una frazione della velocità con cui la fase mobile attraversa la colonna (senza essere trattenuta) e questo rallentamento è proporzionale al numero di molecole di soluto che vi si sciolgono, quindi a k E’ derivabile sperimentalmente dal cromatogramma come: dove tM detto tempo morto è il tempo impiegato dal solo eluente ad attraversare la colonna Un fattore di ritenzione molto minore dell’unità significa che il soluto non è affatto trattenuto dalla colonna,se è troppo grande (20-30) eluisce troppo lentamente. Il valore ottimale è circa 1-5

17 I Parametri Sperimentali
fattore di selettività α E’ il rapporto tra la costante di distribuzione del soluto più fortemente trattenuto (B) e la costante di distribuzione del soluto meno fortemente trattenuto (A) È legato al fattore di ritenzione k e dà una misura di quanto la colonna sia in grado di separare i due analiti. E’ un numero sempre maggiore dell’unità E’ derivabile sperimentalmente dal cromatogramma come:

18 Caratteristiche di una Separazione su Colonna
Selettività E’ definita come la capacita di una colonna di fornire picchi distanziati e dipende dalla temperatura e dalla natura della fase stazionaria. A fianco sono riportati due cromatogrammi, di una miscela di due composti, ottenuti con due diverse fasi stazionarie: nel secondo caso si ha una maggior selettività. La misura sperimentale della selettività è il fattore di selettività α

19 Caratteristiche di una Separazione su Colonna
Efficienza E' la capacita del sistema cromatografico di mantenere compatta la banda di eluizione di una sostanza lungo tutto il percorso della fase mobile. Ciò significa ottenere picchi alti e stretti all’uscita della colonna. La cosa è di grande importanza, perché qualora due sostanze avessero tempi di ritenzione molto vicini se ne potrebbe ottenere ugualmente la separazione. A fianco sono riportati due cromatogrammi di una miscela di due sostanze effettuati con colonne diverse; in ambedue i casi si ha la stessa selettività, ma nel secondo caso si ha una maggior efficienza.

20 Parametri dell’Efficienza di una Colonna
I Piatti teorici Si definisce Piatto Teorico di una colonna cromatografica quel tratto di colonna nel quale una specie chimica si trova in equilibrio fra le due fasi (stazionaria e mobile) prima che l’eludente la trascini ad uno stadio successivo. Se L è la lunghezza della colonna e H l’altezza di ciascun piatto teorico il numero di piatti teorici N di una colonna è dato da: L’efficienza di una colonna è associato ai valori N e H Direttamente proporzionale a N Inversamente proporzionale a H Il numero di piatti teorici può essere ricavato sperimentalmente dal cromatogramma come: Dove tR è il tempo di ritenzione del soluto, e W la larghezza del picco alla sua base. Una colonna efficiente ha elevato N; elevati N si ottengono aumentando la lunghezza della colonna; d’altro canto poiché il fenomeno dell0’alllargamento delle bade con il migrare del solvente èp inevitabile, tempi di residenza troppo lunghi su colonne troppo lunghe portano ad un valore di H troppo elevato ed abbassano l’efficienza.

21 Parametri dell’Efficienza di una Colonna
L’altezza dei Piatti Teorici L’altezza H è una misura indiretta della larghezza della banda. Se u è la velocità lineare della fase mobile Essa dipende sperimentalmente da un grande numero di fattori come Velocità lineare della fase mobile Coefficiente di diffusione nella fase mobile Coefficiente di diffusione nella fase stazionaria Fattore di ritenzione k Diametro della particella di impaccamento N.B. u appare sia al numeratore che al denominatore: il suo valore deve essere quindi attentamente bilanciato.

22 Parametri dell’Efficienza di una Colonna
Fattore B/u detto Fattore di diffusione longitudinale, misura la tendenza del soluto a disperdersi dal centro della banda verso le zone limitrofe. Per ridurlo si può: aumentare il flusso per aumentare la velocità ed al contempo aumentare la viscosità della fase eluente (se è un liquido) o abbassando la temperatura (se è un gas) Fattore Csu detto fattore di trasferimento di massa nella fase stazionaria, misura la velocità con cui un soluto è adsorbito e desorbito da una fase solida; può essere abbassato migliorando l’impaccamento e diminuendo le dimensioni delle particelle Fattore Cmu detto fattore di trasferimento di massa nella fase mobile, misura la diffusione turbolenta del soluto nella fase mobile. Può essere diminuito eliminando i percorsi preferenziali del soluto nella colonna (particelle più piccole e meglio impaccate)

23 Caratteristiche di una Separazione su Colonna
La risoluzione Questo fattore tiene conto sia della selettività che dell’efficienza, e indica il grado di effettiva separazione ottenuto per due sostanze in un processo cromatografico. Dal punto di vista numerico si ottiene dalla relazione: Per avere una buona separazione, dal punto di vista quantitativo, si deve avere risoluzione almeno 0,8

24 Il problema Generale dell’eluizione
Ottenere una risoluzione più alta possibile nel tempo totale di analisi più corto possibile Eluizione isocratica eluizione in condizioni costanti di fase eluente Stessa miscela di solventi per tutta la durata della corsa (in cromatografia liquida) Stessa temperatura per tutta la durata della corsa (in gas-cromatografia) Eluizione in gradiente eluizione in cui si varia la composizione della fase mobile Programmata di solvente (in cromatografia liquida) Programmata di temperatura in (gas-cromatografia) Questo implica lavorare sui tempi di ritenzione di tutti i componenti in modo che siano sufficientemente diversi tra loro ma nessuno troppo lento per evitare l’allargamento di banda. Per lavorare sui tempi di ritenzione si deve scegliere opportunamente la fase eluente.

25 Cromatografia Liquida su Colonna
La cromatografia su colonna è un sistema analogo alla TLC, ma gravitazionale per cui le sostanze che “corrono”di più si trovano nel basso della colonna e vengono eluite per prime. La fase stazionaria impaccata può essere costituita da solidi porosi, liquidi dispersi su solidi, resine a scambio ionico, resine a esclusione.

26 Cromatografia Liquida su Colonna

27 HPLC (High Pressure Liquid Chromatography)
Cromatografia liquida su colonna che impiega materiali di impaccamento con un diametro delle particelle compreso tra 3-10m ( piatti teorici per metro). Le colonne hanno una lunghezza compresa tra cm ed un diametro compreso tra mm Per garantire elevate velocità di flusso (0,1-10 ml/min) la fase mobile è spinta attraverso la colonna da opportuni sistemi di pompaggio ad elevate pressioni e resistenti alla corrosione da parte di numerosi solventi Tali sistemi di pompaggio sono costruiti in maniera tale che i solventi di eluizione possano essere automaticamente miscelati nelle giuste proporzioni prima di entrare in colonna, consentendo di scegliere tra una eluizione isocratica ed una in programmata di solvente. Prima che i solventi vengano aspirati dalle pompe vengono “degassati” tramite il gorgogliamento di un gas inerte che allontana i gas disciolti, e passati attraverso un filtro che elimini piccole scorie solide

28 HPLC

29 HPLC

30 HPLC Sistemi di iniezione o loop

31 HPLC Colonne di guardia
per aumentare la vita di una colonna analitica, in testa ad essa è applicata una colonna di guardia che rimuove dai solventi particelle indisciolte e contaminanti. La composizione di una colonna di guardia dovrebbe essere simile a quella della colonna analitica Rivelatori I rivelatori più ampiamente usati per la cromatografia liquida sono rivelatori spettrofotometrici UV-Vis. La sorgente usata può essere il mercurio (lunghezze d’onda discrete) ma si usano anche filamenti in tungsteno o deuterio equipaggiati con monocromatori. Spesso sono strumenti detti a diode array che possono mostrare l’intero spettro di assorbimento di un analita che entra in colonna. Possono analogamente essere utilizzati spettrofluorimetri o amperometri come rivelatori di specie fluorescenti o redox/attive. Infine un altro tipo di rivelatore che ha trovato molte applicazioni si basa sul cambiamento dell’indice di rifrazione del solvente causato dalle molecole di analita. In contrasto con la maggior parte dei rivelatori precedentemente indicati, questo è meno selettivo perché l’indice di rifrazione è in generale meno specifico per le varie sostanze e può essere influenzato anche da soluti presenti nella fase mobile.

32 Gas-Cromatografia Nella tecnica gas-cromatografica la fase mobile è un gas che fluisce attraverso una colonna in cui si trova la fase stazionaria, la quale può essere un solido granulare poroso oppure un liquido. Secondo lo stato fisico della fase stazionaria, la gas-cromatografia si può suddividere in cromatografia gas solido (GSC) e in cromatografia gas liquido (GLC). Le colonne si dividono in impaccate (largamente usate in passato) o capillari, o tubolari aperte, le quali non contengono particelle (la fase stazionaria è solo presente sulla superficie interna del capillare) L’unica limitazione della gas-cromatografia é la necessità di rendere volatili i campioni da analizzare I meccanismi di separazione relativi alla GC sono sostanzialmente due: ripartizione e adsorbimento, di cui si è già parlato. Il primo nel caso che la fase stazionaria sia liquida, il secondo quando è solida.

33 Gas-Cromatografia

34 Gas-Cromatografia

35 Strumentazione Sistema di alimentazione gas di trasporto (carrier).
Si tratta di bombole di gas inerte (azoto, elio, argon), talvolta può essere utilizzato anche l’idrogeno. Lo scopo principale e quello di trascinare i componenti della miscela in analisi lungo la colonna cromatografica. Iniettore o camera di iniezione. Il suo compito e assicurare l’istantanea vaporizzazione del campione. Poiché con l’uso di colonne capillari la quantità di campione da iniettare e dell’ordine dei nanolitri, e misurare queste quantità con siringhe e praticamente impossibile sono state messe a punto particolari tecniche di iniezione (split) che consentono di far entrare effettivamente in colonna solo una parte dell’iniettato. La camera di iniezione è corredata da un sistema di resistenze variabili attraverso le quali è possibile fissare la temperatura ritenuta più adatta per la vaporizzazione della miscela. L’introduzione del campione viene effettuata con una iniezione su un apposito disco di gomma al silicone.

36 Strumentazione “canalicoli” dell’impaccata Colonna.
La colonna può essere di due tipi: impaccata o capillare. La colonna impaccata (diametro interno 2-4 mm, lunghezza 1-4 m), è costituita da una colonna di acciaio o di vetro(due metri circa) riempita di materiale inerte sul quale e distribuita una pellicola sottile di liquido (fase stazionaria) continuamente attraversata dal gas di trasporto. Le colonne capillari (diametro interno 0,1-0,8 mm, lunghezza m), ormai di uso comune, sono costituite da tubi capillari di vetro con pareti ricoperte di un film sottile di fase stazionaria. molto più lunghe dell’impaccata (anche cento metri), di diametro molto minore e quindi contenenti una quantità molto minore di fase stazionaria, per cui la quantità di campione da iniettare e molto più piccola e viene eluita prima. unico “canalone” della capillare

37 Strumentazione Le colonne sono alloggiate in una camera termostatica, in genere a circolazione di aria calda, sistema col quale viene assicurata una buona stabilita di temperatura. Un dispositivo permette all’operatore di fissare la temperatura, la quale può essere mantenuta costante per tutta la durata dell’analisi (isoterma) oppure fatta variare (programmata).

38 Rivelatore I dispositivi in grado di rivelare la presenza di una sostanza estranea nel gas di trasporto, a valle della colonna, possono dividersi in universali e selettivi. I primi consentono di individuare tutti i componenti di una miscela, i secondi rivelano solo particolari categorie di composti. Tra i rivelatori più usati, si segnalano: Rivelatore a ionizzazione di fiamma (FID) Spettrometro di massa rappresenta il rivelatore ideale per la gascromatografia, perché permette di analizzare in tempo reale i singoli picchi in uscita dalla colonna, effettuando sia un’analisi qualitativa che quantitativa, mediante il confronto dello spettro di massa ottenuto con uno dei numerosi spettri memorizzati nella banca dati.