ENZIMI Catalizzatori prodotti da cellule viventi ma capaci di agire indipendentemente da esse Determinano tutti i processi di degradazione, sintesi,

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3 ENZIMI Catalizzatori prodotti da cellule viventi ma capaci di agire indipendentemente da esse Determinano tutti i processi di degradazione, sintesi, trasformazione e conservazione dell’energia nella formazione ed evoluzione della materia vivente.   Sono PROTEINE spesso associate ad un metallo o molecola organica

4 CATALISI ⇓ legata ai gruppi R degli amminoacidi la cui natura e disposizione residua individua una tasca detta SITO ATTIVO. E’ fondamentale la conformazione nativa della proteina per la sua funzione catalitica.   DENATURAZIONE ⇒ MODIFICA STRUTTURA NATIVA ⇒ DISATTIVAZIONE DELL’ENZIMA  

5 Complementarità geometrica e fisica tra un E ed un substrato dipendente da forze non covalenti

6 CATALISI OMOGENEA sub. e cat. nella stessa fase
CATALISI ETEROGENEA sub. e cat. in fasi diverse Incremento di velocità volte con eventuale fondamentale intervento di componenti non proteiche (ioni Me o coenzimi). Struttura tridimenzionale dell’E fondamentale per la conoscenza dello stato di transizione e quindi del meccanismo di reazione. SITO ATTIVO = PARTE DELL’ENZIMA IN CONTATTO CON IL SUBSTRATO (zona piccola in confronto alle dimensioni dell’enzima). Modificazioni sito attivo scomparsa attività enzimatica.

7 Molecola su cui opera l’enzima = substrato
Struttura primaria e strutture superiori determinate dalla sintesi proteica = predestinazione di una proteina a funzionare da enzima.  PM enzimi = da a 106 Molecola su cui opera l’enzima = substrato DIMENSIONE ENZIMA » DIMENSIONE SUBSTRATO

8 Apoenzima(denaturato con cal.) +
cofattore o gruppo prostetico (stabile al riscaldamento) ⇓ Enzima completo (oleoenzima) Enzimi richiedono cofattori per funzionare che possono essere ioni inorganici (Fe, Mg, Mn, Zn, Mo etc.) o molecole organiche (coenzimi) che possono essere:   legati debolmente alla proteina   legati saldamente alla proteina (gruppo prostetico)

9 ATP ⇒ metabolita coezimatico + comune (cosubstrato modificato nella reazione e dissociato)
NAD+ e NADP+ ⇒ coenzimi nucleotidici piridinici associati a deidrogenasi che catalizzano il trasferimento di un H- da un substrato al nucleotide portandolo nella forma ridotta con rilascio di H+ Coenzima A ⇒ coenzima derivato dall’acido pantotenico è coinvolto nel trasferimento di gruppi acilici CH3CO- Altri coenzimi sono: Biotina, Acido Lipoico, vitamine A, D, E e K.

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11 Enzimi identificati da 4 numeri: 1
Enzimi identificati da 4 numeri:   1.   Appartenenti a una delle classi relative alla reazione catalizzata 2.   Appartenenza ad una sottoclasse 3.   Appartenenza ad una sottosottoclasse Posizione progressiva nella sottosottoclasse

12 Esempio ATP + glucosio = ADP + glucosio-6-fosfato Catalizzatore esochinasi (nome comune) o ATP-glucofosfotransferasi (catalizza il trasferimento del P da ATP a glucosio). Numero dell’enzima classe delle transferasi 7. sottoclasse fosfotransferasi 1.   sottosottoclasse fosfotransferasi con OH come gruppo accettore 1.glucosio come accettore del gruppo fosforico.

13 SPECIFICITA’ DEGLI EMZIMI
Enzima Chirale riesce a distinguere tra gruppi della molecola stericamente non equivalenti. Risulta perciò altamente specifico e distingue due diversi stereoisomeri o nella reazione con un centro Pro-chirale genera uno solo dei possibili isomeri (geometrici o ottici) SPECIFICITA’ DEGLI EMZIMI Un enzima può avere diversi gradi di specificità: Specificità che tiene conto del legame (specificità di legame, Bassa specificità) Specificità che tiene conto di una parte della molecola (specificità di gruppo) Specificità che richiede le due parti della molecola ed il legame che le unisce (specificità assoluta).

14 Es. A-B + H2O = AOH + BH la natura di A e B non è importante A o B devono essere determinate A e B devono essere del tipo appropriato. Maltasi: catalizza l’idrolisi del maltosio ma essa può operare sugli a-glucosidi cioè sul glucosio legato con legame a-glucosidico ad un altro zucchero qualsiasi (specificità di gruppo).

15 Meccanismo reazione enzimatica
Catalisi per abbassamento Ea per stabilizzazione chimica del complesso attivato e/o + corretto orientamento geometrico per la formazione del complesso attivato E con S forma ES ad energia + bassa in un equilibrio non alterato, riuscendo a discriminare tra parecchi substrati (specificità) in competizione per il S.A. nel quale ci sono gruppi funzionali che: Reagiscono temporaneamente con S Predispongono S a formare P

16 I gruppi catalitici di E interagendo con S lo preparano (attivano) alla reazione abbassando Ea.
Tra substrato-enzima si forma il complesso ES la cui energia di legame serve per: Compensare la riduzione dell’entropia (avvicinamento e orientamento substrato) desolvatare il substrato indurre binding produttivo o adattamento indotto Dall’energia del legame E-S dipendono la catalisi e la specificità.

17 DIVERSI TIPI DI CATALISI
Catalisi acido base specifica se dovuta a H+ o OH- o generale se dovuta a gruppi accettori o donatori di protoni (sulle catene laterali degli a.a. e più comune al pH 7 della cellula) Catalisi covalente mediante formazione di un complesso attivato stabile per la formazione di legami covalenti tra E ed S.

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19 Meccanismo catalisi enzimatica

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22 Andamento cinetico

23 Il sito attivo

24 Cinetica Enzimatica Vo [S]
La velocità iniziale di una reazione aumenta quasi linearmente all'aumentare della concentrazione di substrato. Vo La velocità è direttamente proporzionale alla concentrazione del substrato e la reazione è di primo ordine V = k [S] [S]

25 Cinetica Enzimatica Vmax V
La proporzionalità fra V e [S] progressivamente diminuisce. Vmax V La velocità iniziale diventa indipendente dalla [substrato] e la reazione è di ordine zero rispetto al substrato. All’aumentare della concentrazione di substrato la proporzionalità fra V e [S] progressivamente diminuisce, e si registrano solo minimi incrementi di velocità anche per elevate variazioni della concentrazione di substrato. Il valore della velocità misurato in queste condizioni viene detto velocità massima o Vmax. [S]

26 La costante di Michaelis (KM)
affinità

27 Effetti della concentrazione dell’enzima
Raddoppiando le molecole di enzima avremmo il doppio di molecole di substrato legate all'enzima e ci si aspetterebbe un raddoppio della velocità, come è in realtà: Vmax è direttamente proporzionale alla [E] Km è indipendente dalla [E] e dalla [S]

28 kcat o numero di turnover
Unità Internazionale la quantità di enzima che catalizza la formazione di una micromole di prodotto in un minuto kcat o numero di turnover il numero di molecole di substrato convertite in prodotto nell'unità di tempo da una molecola di enzima quando è saturata con il substrato. La concentrazione dell’enzima può essere espressa in termini di attività osservata.

29 kcat kcat kcat kcat kcat E + S ES E + P kcat = k2 Vmax = kcat [ET]
attività molecolare La costante di velocità indicata come kcat identifica la costante della tappa limitante la velocità della intera reazione Se una reazione si verifica secondo un meccanismo a due stadi come quello previsto da Michaelis-Menten E’ una costante di primo ordine ed è espressa in s-1 . efficienza catalitica

30 Enzima kcat catalasi anidrasi carbonica acetilcolinesterasi 14 000 lattato deidrogenasi 1 000 chimotripsina 100 DNA polimerasi 15 lisozima 0,5

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33 Che cosa influenza la velocità della reazione?
Velocità di reazione pH Pepsina Chimotripsina Tripsina Temperatura, °C Velocità di reazione TEMPERATURA pH A number of external factors affect the activity of enzymes in speeding conversion of reactants to products. These factors, including variations in the concentration for substrate molecules, temperature, and pH, speed or slow enzymatic activity in highly characteristic patterns. A higher temperature generally results in an increase in enzyme activity. As the temperature rises, the movement of enzyme molecules and substrate molecules increases. This causes more collisions between enzyme and substrate and the net result is the formation of more product. If the temperature rises beyond a certain point, however, the enzyme activity eventually levels out and then declines rapidly because the enzyme is denatured by heat. The enzyme shape change during denaturation and can not catalyze the reaction and there is shape drop in the rate of the reaction with change in temperature. The effect of pH on Enzyme Activity A change in pH can also effect enzyme activity. Each enzyme has an optimal pH range that help maintain its normal configuration in an environment which it operates. Pepsins is a proteolytic enzyme found in the stomach and functions at pH 2. At pH 2 the tertiary structure of pepsin is not altered and will catalyze the reaction. Trypsin is and enzyme found in the small intestine and prefer a pH of about 8. The tertiary structure of a protein depends on interactions such as hydrogen bonding, between R groups. A change in pH can alter the ionization of these side chains and disrupt the normal configuration and in some case denature the enzyme. A denatured protein can not combine with a substrate. Andamento variabile con uno o più massimi di attività a diversi pH. A pH estremi: si può alterare irreversibilmente la stabilità dell’enzima si può modificare la ionizzazione di S influenzando il legame ES si può modificare la ionizzazione dell’E modificandone l’affinità per S si può modificare la ionizzazione la ionizzazione del complesso ES Gli effetti 2 e 3 influenzano la KM il 4 la Vmax. La velocità aumenta all’aumentare di T, ma nella catalisi enzimatica un aumento di T può portare ad una variazione di conformazione con perdita conseguente dell’attività catalitica. Di solito si ha un max di attività tra 40°C e 60°C e la denaturazione completa a °C.

34 Influenza della temperatura
Lo studio attività/temperatura permette di calcolare dall’equazione di Arrenius K=A e-Ea/RT dalla cui linearizzazione si possono calcolare: Ea (molto + basso nelle reazioni enzimaticamente catalizzate) Q10= coefficiente termico ovvero fattore di cui aumenta la velocità quando T aumenta di 10°C. Reazioni non catalizzate Q10= 2 Reazioni catalizzate <Q10< 2

35 Influenza del pH Andamento variabile con uno o più massimi di attività a diversi pH. A pH estremi: si può alterare irreversibilmente la stabilità dell’enzima si può modificare la ionizzazione di S influenzando il legame ES si può modificare la ionizzazione dell’E modificandone l’affinità per S si può modificare la ionizzazione la ionizzazione del complesso ES Gli effetti 2 e 3 influenzano la KM il 4 la Vmax.

36 REAZIONI CON PIU’ SUBSTRATI
Reazioni sequenziali = reazioni con + substrati tutti presenti affinchè si abbia la liberazione di prodotti

37 Reazioni a ping-pong = prodotto liberato prima che tutti i substrati siano stati legati.
S1 per primo si lega ad E che subisce una modificazione per sostituzione liberando il primo prodotto: poi l’enzima modificato si lega al secondo substrato S2 formando il secondo prodotto e liberando l’E nella forma originaria.

38 SISTEMI MULTIENZIMATICI
Reagiscono in una serie consecutiva di reazioni in cui P diventa S della reazione successiva (azione concertata da 2 a 20 E di reazioni in sequenza). Sistemi multienzimatici in fase solubile (glicolisi) Sistemi multienzimatici fisicamente associati con ridotti problemi di diffusione (ac. grasso sintetasi) Sistemi associati a membrane o ribosomi (complessi della catena respiratoria)

39 Inibitori enzimatici Irreversibili Reversibili
Gli inibitori sono composti che interagendo con l'enzima ne riducono la sua velocità di reazione. Si trovano naturalmente nelle cellule, dove controllano la velocità di reazione dei processi metabolici, o introdotti artificialmente nei processi come strumenti sperimentali. Molti composti tossici sono inibitori enzimatici e perciò causano un'inibizione dei processi vitali complessivi. Il modo di interagire con l'enzima è estremamente vario e lo studio dei processi cinetici ci permette di delucidare i vari meccanismi.

40 INIBIZIONE ENZIMATICA
Inibitori (I) =diminuiscono le velocità di reazione L’inibitore può legarsi all’enzima mediante legami: Fisici (inibizione reversibile) con l’allontanamento di I si ripristina l’attività di E Chimici (inibizione irreversibile) la formazione di legami covalenti impedisce il semplice allontanamento dell’I.

41 INIBIZIONE REVERSIBILE
Inibizione competitiva = I compete con S per il sito attivo di E Si può ridurre aumentando la [S]. Cambia KM non cambia Vmax Inibizione non competitiva = I si lega ad E in un sito diverso dal sito attivo. Si abbassa la Vmax ma non si modifica la KM Inibizione incompetitiva = I si lega solo al complesso ES. E + S  ES  E+P; ES+I  ESI Si modificano entrambe le costanti cinetiche.

42 Inibizione Competitiva
Inibizione competitiva per formazione di legami col sito attivo                                                                                                                                                                                        Da un punto di vista classico un inibitore competitivo è un composto che ha una stretta somiglianza strutturale e chimica col substrato. Questa somiglianza lo fa legare al sito attivo al posto del substrato. mutuamente escludenti

43 Un inibitore competitivo ridurrà l'affinità enzima substrato, cioè aumenterà il valore di Km.
Ad alte concentrazioni di substrato la reazione non viene rallentata e Vmax è sempre la stessa.

44 Inibizione non-competitiva
Inibizione competitiva per cambiamento di conformazione L'inibitore non si lega al sito attivo ma in un'altra zona dell'enzima tipica per quell'inibitore, che è localizzata in una porzione diversa dell'enzima stesso. Quando l'inibitore si lega causa un cambiamento della forma tridimensionale dell'enzima che ha come conseguenza una modificazione del sito attivo e la conseguente impossibilità per il substrato di legarsi ad esso. mutuamente escludenti

45 Il substrato non viene più convertito in prodotto
Inibizione incompetitiva Il substrato non viene più convertito in prodotto Un inibitore noncompetitivo si lega al suo sito sull'enzima, lontano dal sito attivo, causando un cambio nella conformazione del sito attivo stesso. In ciò è molto simile agli inibitori competitivi. La differenza sta nel fatto che il substrato si lega comunque al sito attivo ma esso non viene più convertito in prodotto come esemplificato dall'animazione.                                                                                                     Un classico inibitore non competitivo non ha influenza sulla capacità di legarsi del substrato all'enzima anche se il sito attivo è stato modificato nella sua forma, ma l'affinità sarà comunque ridotta. Questi inibitori misti noncompetititvi sembrano avere alcune prorpietà dei competitivi e dei non competititivi. Di fatto inibitori classici non competitivi sono rari, se esistono del tutto. Questi possono essere distinti dai competitivi per il loro effetto sui parametri cinetici..

46 I                                                                                                                                                 La KM rimane invariata La Vmax diminuisce

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50 Gli inibitori irreversibili si combinano o distruggono un gruppo funzionale dell’enzima essenziale per l’attività catalitica. Es. Inibitori suicidi o inattivatori basati sul meccanismo che portano avanti le prime tappe della reazione enzimatica normalmente, poi invece di essere convertiti nel prodotto di reazione diventando composti molto reattivi che si legano irreversibilmente all’enzima. Inibizione da prodotto = prodotto che compete con il S al sito attivo formando EP.

51 ATTIVITA’ ENZIMATICA = misura della variazione di concentrazione di reagente o prodotto nel tempo. Misurata in unità di attività (UA) come la quantità di E utile per trasformare una micromole di S in P al minuto (a pH e [S] ottimali). Attività specifica =unità di enzima per mg di proteina (maggiore quanto maggiore è la purezza dell’enzima). Attività molecolare =unità per micromole di E alla [S] ottimale, cioè il numero di molecole di substrato trasformate per minuto per molecola di enzima Unità di misura in katal = quantità di E che trasforma una mole di S al secondo (si usano i sottomultipli come microkatal o nanokatal). Per l’attività specifica katal/kg di proteina.

52 DOSAGGIO ATTIVITA’ ENZIMATICA
Attività enzimatica dipendente da : T, pH, con. substrato, conc. cofattori. Le misure di attività vanno fatte in condizioni definite e controllate. Si sceglie una conc. di substrato saturante ([S] >10KM) dopo aver calcolato dalla Michaelis-Menten i valori di KM e Vmax. La misura della velocità iniziale Vo a pH e T ottimali dipende solo dalla [E]. Si aggiungono gli eventuali cofattori indispensabili per la catalisi. La commissione internazionale ha suggerito di usare la T=25°C e nei paesi tropicali 37°C.

53 I metodi analitici più usati per il dosaggio misurano l’assorbanza del S o preferibilmente P nel tempo. Accanto ai dosaggi ottici esistono metodi fluorimetrici, manometrici, polarografici o radioattivi per dosare l’attività enzimatica. L’attività specifica è più utile di quella totale se si desiderano seguire le fasi di purificazione dell’E da una matrice reale.

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61 specificità substrati reazioni complementarietà strutturale
mutuo riconoscimento

62 modulazione dell’attività
quantità di proteina enzimatica regolazione

63 REGOLAZIONE E CONTROLLO DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA
Enzimi regolatori sono capaci di modulare la attività catalitica in risposta di certi segnali. Nei metabolismi possono lavorare insieme in modo sequenziale, ma almeno uno determina la velocità complessiva catalizzando la reazione più lenta (enzima regolatore). In molti sistemi multienzimatici il I enzima di ogni sequenza è un enzima regolatore. Regolazione: Allosterica (azione mediante altra forma assunta per il legame reversibile con un metabolita regolatore detto modulatore). Modificazione da legame covalente (gruppi chimici modificanti AMP, P, gruppi metili legati covalentemente all’E) Queste due classi di enzimi sono proteine a struttura quaternaria che spesso non ha sulla stessa subunità sito attivo e sito regolatore. Quando il substrato si comporta da modulatore l’enzima è detto omotropico se si tratta di molecola diversa eterotropico.

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66 Gli E regolatori non seguono il modello di Michaelis e Menten con andamento a sigmoide invece che iperbolico della curva Vo –[S] dovuto a interazioni cooperative tra le subunità dell’E.

67 Regolazione della glicogeno fosforilasi
mediante modificazioni covalenti

68 MECCANISMI DI INDUZIONE E REPRESSIONE
Regolazione della produzione  concentrazione di E Meccanismi di sintesi proteica rispetto alla produzione di E nelle diverse condizioni metaboliche: Enzimi costitutivi= prodotti a v costante (C costante) indipendentemente dallo stato metabolico dell’organismo  permanentemente presenti nella cellula Enzimi inducibili = prodotti in c.n. in piccolissime quantità, ma con produzione aumentata in risposta a speciali sostanze (es. b-galattosidasi per E. coli) La repressione può essere indotta da particolari sostanze che fanno scomparire dal corredo enzimatico alcuni enzimi coinvolti nella sintesi dell’E in questione Interessano i processi di sintesi proteica e coinvolgono fenomeni a livello genetico e sono esempi di risparmio energetico .

69 ZIMOGENI= PRECURSORI INATTIVI DI MOLTI ENZIMI
La loro attivazione avviene con scissione proteolitica di una parte di essi (es.chimotripsina e tripsina) ISOENZIMI= FORME MULTIPLE DI ENZIMI CHE DIFFERISCONO IN COMPOSIZIONE DI a.a. Catalizzano la stessa reazione con diversa cinetica (Km e Vmax) come la lattico deidrogenasi (5 isoenzimi)

70 ENZIMI NEL TERRENO Sono prevalentemente liberi ed extracellulari e possono rimanere stabili ed attivi per migliaia di anni. Nel suolo esiste attività catalitica inorganica ed enzimatica, ma quest’ultima è molto più efficiente e eliminabile con trattamenti termici energici ( °C per h per una distruzione totale) Due grandi categorie E cellule proliferanti E accumulati (liberi o immobilizzati) Per distinguere tra gli accumulati e i proliferanti può usare un agente sterilizzante (toluene o ossido di etilene o radiazioni UV) che estinguono l’attività microbica, ma non modificano quella degli esoenzimi.

71 Nel suolo 4 classi di E: Ossidoreduttasi Idrolasi Liasi Transferasi La prime due sono predominanti Polisaccaridasi e proteinasi (idrolasi) demoliscono macromolecole come carboidrati e proteine e sono essenziali per i cicli biologici di C e N. Fosfatasi e solfatasi (idrolasi extracellulari) producono P e S nutrienti per le piante. Altre idrolasi demoliscono fitofarmaci e xenobiotici. Deidrogenasi (ossidoreduttasi intracellulari) danno informazioni sull’attività biologica delle popolazioni microbiche.

72 E del suolo usati come indicatori di fertilità
Nel suolo c’è una correlazione tra sostanze umiche e attività enzimatiche ( attività esterasica prop. al contenuto di S.O.) Le attività enzimatiche decrescono nel profilo del terreno più rapidamente della S.O. L’attività degli enzimi nel terreno riguarda alcune delle più importanti trasformazioni nel ciclo di C, N, P, S. Il terreno ad es. contiene ureasi (da animali attraverso il ciclo dell’urea), che condiziona la fertilizzazione ureasica. Le attività enzimatiche nel suolo possono essere considerate come indici di fertilità.Ogni tipo di terreno può essere caratterizzato per il suo patrimonio in attività enzimatica, che si mostra efficiente anche quando le condizioni ambientali sono proibitive per i microorganismi e, in casi limite, può aiutare la ripresa vegetativa per la piante e l’avvio delle attività microbiche col ripristino delle condizioni favorevoli.

73 ENZIMI IMMOBILIZZATI Nel terreno esistono attività enzimatiche extracellulari associate a costituenti colloidali organici (humus) ed inorganici (argille e ossidi) del suolo. Gli E vengono trasformati da catalizzatori omogenei in eterogenei. L’immobilizzazione di un enzima comporta una diminuzione dei gradi di libertà rispetto ed E libero. Tuttavia in vari settori farmaceutici ed industriali gli E immobilizzati risultano efficienti catalizzatori specifici eterogenei. E immobilizzato: Può essere riusato Può essere usato in processi continui Può presentare minor sensibilità ad agenti disattivanti Può essere preparato per usi particolari

74 Effetti dell’immobilizzazione
Svantaggi  -Cambi di conformazione che possono rendere il sito attivo meno accessibile  -Riduzione della concentrazione effettiva dell’enzima   -Effetti microambientali di diversità di intorno del sito attivo rispetto alla soluzione E immobilizzato ha una più alta Km, diversa specificità di substrato, diverso optimum di pH e T. Vantaggi     Maggiore resistenza termica      Maggiore resistenza proteolitica, agli inibitori ed ai Me pesanti     Possibilità di riutilizzo + volte con separazione ed allontanamento dei prodotti di reazione.

75 Le conoscenze sugli E immobilizzati ha consentito applicazioni tecnologiche e preparazione di modelli simulando sistemi reali in piante, terreno e acque per interpretare osservazioni sperimentali e migliorare le conoscenze di base. E di sistemi multienzimatici, specie se associati a membrane cellulari possono essere considerati esempi di enzimi immobilizzati che operano su sistemi viventi.

76 INTERAZIONI TRA E DEL SUOLO E RESIDUI FITOFARMACI
Dipendono da ·       Natura e dose del composto ·       Tipo di enzima ·       Tipo di terreno ·       Condizioni ambientali

77 Si possono avere tre situazioni:
1.   Attività enz. aumenta dopo il trattamento (prodotto usato da alcune classi di microorg.) 2.   Attività enz. inalterata (terreno biologicamente morto può conservare attività enz.) 3.   Attività enz. ridotta o annullata dal trattamento (conseguenze agronomiche serie)  Le tre situazioni possono verificarsi contemporaneamente per le diverse attività enzimatiche. Anche operando solo su alcuni enzimi un erbicida può alterare l’equilibrio del corredo enzimatico del suolo con riflessi più o meno pronunciati su tutto l’ecosistema.