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Enzimi
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“Proteine che agiscono da catalizzatori biologici aumentando enormemente la velocità delle reazioni biochimiche”
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PROPRIETÀ DEGLI ENZIMI
Alta specificità dotati di elevatissimo grado di specificità, maggiore di qualunque catalizzatore chimico Alta velocità di reazione aumentano la velocità di reazione fino a 1012 volte rispetto alla stessa reazione non catalizzata da enzimi Capacità di regolazione inibizione a feedback, controllo allosterico, modificazione covalente, variazioni della quantità di enzima Agiscono in condizioni moderate temperature inferiori a 100 °C, pressione atmosferica, pH neutro Catalizzatori in grado di catalizzare molte volte la stessa reazione senza produrre sottoprodotti indesiderati
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Sintesi proteica OLOENZIMA Apoenzima (inattivo) Zimogeno Apoenzima
(precursore) Apoenzima (parte proteica) gruppo prostetico (legato covalentemente) OLOENZIMA Apoenzima (inattivo) ione metallico coenzima (vitamina)
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Coenzimi Coenzima Precursore Biocitina Biotina
5‘-Deossiadenosilcobalamina Vitamina B12 Flavin adenin dinucleotide Riboflavina (B2) Acido lipoico Acido lipoico Nicotinamide adenin dinucleotide Ac. Nicotinico Piridossal fosfato Piridossina (B6) Tetraidrofolato Folato Tiamin pirofosfato Tiamina (B1)
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Elementi inorganici che servono come cofattori di enzimi
Cu2+ Citocromo ossidasi Fe2+ o Fe 3+ Catalasi, perossidasi K+ Piruvato cinasi Mg2+ Esochinasi, glucosio-6-fosfatasi Mn2+ Arginasi Mo Dinitrogenasi Ni2+ Ureasi Se Glutatione perossidasi Zn2+ Anidrasi carbonica, alcool deidrogenasi
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Velocità delle reazioni
X + Y Z La velocità di una reazione varia con la temperatura secondo l’equazione di Arrehenius: Velocità = Ae - Ea/RT Dove A è la costante nota come fattore pre-esponenziale, correlata alla frequenza con cui le molecole si urtano con il giusto orientamento ed alla probabilità che la collisione avvenga con un’energia sufficiente a far avvenire la reazione, Ea rappresenta l’energia di attivazione (J mol-1), R la costante dei gas (J mol-1K-1) e T la temperatura assoluta
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ENERGIA DI ATTIVAZIONE
La conversione S --> P è termodinamicamente favorevole (P si trova ad uno stato energetico inferiore rispetto a S), ma la reazione non può avvenire se S non acquisisce sufficiente energia per superare la barriera dell’energia di attivazione Stato di transizione S P Energia Coordinte di reazione ENERGIA DI ATTIVAZIONE Ea
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Come agiscono gli enzimi?
Si combinano transientemente con il substrato e ne abbassano l’energia di attivazione Non spostano l’equilibrio della reazione, ma aumentano la velocità con cui l’equilibrio viene raggiunto Non subiscono modificazioni permanenti durante la reazione e sono subito disponibili per catalizzare una nuovo ciclo di reazione
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Distribuzione delle energie cinetiche
Molecole con valori medi di energia Molecole che possiedono energia sufficiente per reagire in una reazione catalizzata da un enzima Numero di molecole Molecole che possiedono energia sufficiente per reagire in una reazione non catalizzata Energia cinetica delle molecole
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S P E + S ES EP E+ P Reazione non catalizzata
Reazione catalizzata da un enzima E + S ES EP E+ P
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Profilo energetico di una reazione catalizzata da un enzima
Stato di transizione Eatt (non enzimatica) Stato di transizione Energia Eatt (enzimatica) E + S Stato di transizione ΔG° ES E + P EP Coordinate di reazione
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Misura dell’attività enzimatica
Mi permette di determinare la quantità di enzima presente in un campione Solitamente si sfrutta la proprietà intrinseca dell’enzima di catalizzare una reazione
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Supponiamo di voler determinare la quantità di Lattico deidrogenasi (LDH) presente nel sangue di un paziente LDH Piruvato + NADH Lattato + NAD+ 340 nm ABS NADH NAD+ Lunghezza d’onda
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Cuvetta (quarzo-vetro-plastica)
Preparazione test Tampone Substrato Cuvetta (quarzo-vetro-plastica) Miscela tampone-substrato
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Scelta della lunghezza d’onda
1 2 3 4 5 6 7 8 9 START STOP
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Spettrofotometro 340 nm 0.000 Lunghezza d’onda ABS minuti 2.000 1.000
1 2 minuti
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Posizionamento della cuvetta nello spettrofotometro
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ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
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ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
21
ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
22
ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
23
ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
24
ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
25
ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
26
ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
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ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
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ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
29
ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
30
ABS 340 nm 1.546 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
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ABS 340 nm 1.546 minuti 2.000 1.000 0.000 1
1 2 minuti
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Aggiunta dell’enzima (cofattore o substrato)
Rapido mescolamento
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Inizia la reazione enzimatica ABS 340 nm
1.546 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti Inizia la reazione enzimatica
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ABS 340 nm 1.516 minuti 2.000 1.000 0.000
1 2 minuti
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ABS 340 nm 1.493 minuti 2.000 1.000
0.000 1 2 minuti
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ABS 340 nm 1.479 minuti 2.000 1.000
0.000 1 2 minuti
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ABS 340 nm 1.449 minuti 2.000 1.000
0.000 1 2 minuti
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ABS 340 nm 1.411 minuti 2.000
1.000 0.000 1 2 minuti
39
ABS 340 nm 1.390 minuti 2.000
1.000 0.000 1 2 minuti
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ABS 340 nm 1.343 minuti 2.000
1.000 0.000 1 2 minuti
41
ABS 340 nm 1.317 minuti
2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
42
ABS 340 nm 1.289 minuti
2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
43
ABS 340 nm 1.274 minuti
2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
44
ABS 340 nm 1.245
2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
45
ABS 340 nm 1.224
2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
46
ABS 340 nm 1.189
2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
47
ABS 340 nm 1.156
2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
48
ABS 340 nm
1.123 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
49
ABS 340 nm
1.098 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
50
ABS 340 nm
1.053 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
51
ABS
340 nm 1.012 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
52
ABS
340 nm 0.994 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
53
ABS
340 nm 0.964 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
54
ABS 340 nm 0.938 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
55
ABS 340 nm 0.910 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
56
ABS 340 nm 0.889 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
57
ABS 340 nm 0.868 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
58
ABS 340 nm 0.861 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
59
ABS 340 nm 0.844 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
60
ABS 340 nm 0.821 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
61
ABS 340 nm 0.803 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
62
ABS 340 nm 0.789 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
63
ABS 340 nm 0.777 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
64
ABS 340 nm 0.759 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
65
ABS 340 nm 0.719 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
66
ABS 340 nm 0.690 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
67
ABS 340 nm 0.657 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
68
ABS 340 nm 0.634 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
69
ABS 340 nm 0.611 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
70
ABS 340 nm 0.592 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
71
ABS 340 nm 0.558 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
72
ABS 340 nm 0.528 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
73
ABS 340 nm 0.499 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
74
ABS 340 nm 0.459 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
75
ABS 340 nm 0.425 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
76
ABS 340 nm 0.399 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
77
ABS 340 nm 0.384 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
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La registrazione viene bloccata
ABS 340 nm 0.380 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti La registrazione viene bloccata
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Determinazione dell’attività enzimatica
ABS 340 nm 0.380 2.000 1.000 0.000 1 2 minuti
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? Occorre calcolare la velocità della reazione
Se vengono rispettate determinate condizioni, la velocità della reazione è direttamente proporzionale alla concentrazione di enzima ?
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In condizioni di stato stazionario
k1 k3 E + S ES E + P k2 k1 >> k2 Velocità= k3[ES] k1 ≥ k3 se la concentrazione di substrato è sufficientemente elevata [E] [ES]
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In condizioni di stato stazionario
k1 k3 E + S ES E + P k2 Fino a quando [E] >>[S] V = costante V = k3[ES] [E] k1 >> k2 k1 ≥ k3
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Andamento della velocità iniziale in funzione della concentrazione di substrato
• [S] Vo V max L’equazione matematica che esprime la relazione iperbolica tra la velocità iniziale e la concentrazione del substrato viene detta equazione di Michaelis-Menten ½ Vmax v = Vmax [S] Km [S] Km
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Determinazione dell’attività enzimatica
ABS 340 nm 0.380 2.000 Pendenza A/min 1.000 0.000 1 2 minuti
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Determinazione dell’attività enzimatica
ABS 340 nm 0.380 2.000 Velocità costante 1.000 0.000 1 2 minuti
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In condizioni di [S] saturanti
ABS 340 nm 0.380 2.000 La velocità della reazione non aumenta all’aumentare della concentrazione di substrato 1.000 0.000 1 2 minuti In tali condizioni la velocità è direttamente proporzionale alla concentrazione di enzima
![In condizioni di [S] saturanti](http://slideplayer.it/slide/3027926/11/images/86/In+condizioni+di+%5BS%5D+saturanti.jpg "ABS. 340 nm La velocità della reazione non aumenta all’aumentare della concentrazione di substrato. minuti. In tali condizioni la velocità è direttamente proporzionale alla concentrazione di enzima.")
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Determinazione dell’attività enzimatica
Variazione di assorbimento Volume totale test A Vtot Unità enzimatiche UI = d t Vc Volume enzima Coefficiente di estinzione (mM o M) del substrato Tempo Cammino ottico
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L’attività di un enzima viene misurata in termini di “Unità enzimatiche” o “Unità Internazionali”
“Unità enzimatica” Quantità di enzima capace di trasformare una micromole (mole) di substrato in un minuto per ml di soluzione
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In condizioni di [S] saturanti
1 unità di enzima Velocità 2 unità di enzima 3 unità di enzima Tempo Incrementando la concentrazione di enzima aumenta la pendenza della retta
![In condizioni di [S] saturanti](http://slideplayer.it/slide/3027926/11/images/89/In+condizioni+di+%5BS%5D+saturanti.jpg "1 unità di enzima. Velocità. 2 unità di enzima. 3 unità di enzima. Tempo. Incrementando la concentrazione di enzima aumenta la pendenza della retta.")
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Metodi Continuo A tempo fisso
L’operatore segue la reazione “in tempo reale”: è possibile capire se stiamo eseguendo effettivamente una misura di velocità iniziale la velocità enzimatica deve rimanere costante. In tali condizioni la velocità di reazione risulta direttamente proporzionale alla concentrazione dell’enzima da misurare L’operatore fa partire la reazione e la blocca dopo un periodo di incubazione prescelto è essenziale che durante tale periodo la reazione sia di ordine zero relativamente alla concentrazione del substrato e la velocità enzimatica sia quindi sempre massima
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Continuo ABS ABS v0 v0 Tempo Tempo ABS v0 Tempo
Problemi di mescolamento, effetto diluizione…. ABS Soluzione concentrata di enzima v0 Tempo
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A tempo fisso v0 ABS ABS v0 Tempo Tempo v0 Tempo
STOP ABS ABS STOP v0 Tempo Tempo STOP Elevata concentrazione di enzima v0 Campione non mescolato, precipitato….. Tempo
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Tipologia di analisi Test accoppiato: Test semplice:
Si rende necessario quando nessuno dei composti che prendono parte o si formano nella reazione enzimatica può essere sfruttato per seguire l’andamento della reazione. Occorre accoppiare la reazione “primaria” con una seconda reazione definita “indicatrice” Test semplice: Nella soluzione di reazione è presente un solo enzima. La reazione può essere seguita monitorizzando la scomparsa del substrato, la formazione del prodotto, le variazioni spettroscopiche di qualche coenzima (NADH, NADPH per esempio)
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Test ottico semplice (test di Warburg)
deidrogenasi A + NADH + H B + NAD+ 340 nm ABS NADH o NADPH NAD+ o NADP+ Lunghezza d’onda
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Test ottico accoppiato
A + B C + D enzima deidrogenasi D + NADH + H E + NAD+ creatinfosfocinasi Creatinfosfato+ ADP Acido piruvico + ATP esocinasi Glucosio + ATP Glucosio-6-P + ADP Glucosio-6-P deidrogenasi Glucosio-6-P + NADP Acido lattico + NADPH + H+
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Per effettuare un dosaggio enzimatico in maniera corretta occorre:
Uniformare la temperatura (30°C) Scegliere il valore di pH ottimale Escludere la presenza di inibitori (reversibili o irreversibili)
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