METODI IMMUNOMETRICI (I)

METODI IMMUNOMETRICI (I)
I metodi immunometrici, sfruttando le caratteristiche uniche di selettività e di avidità del legame antigene (analita)-anticorpo, permettono lo sviluppo di metodi altamente specifici per la quantificazione dell’analita, anche in matrici complesse. complesso analita-anticorpo analita + anticorpo quantificazione del

METODI IMMUNOMETRICI (II)
L’avidità del legame analita-anticorpo si misura con la costante di affinità Kaff che è a tutti gli effetti una costante termodinamica di equilibrio (Keq). Un anticorpo idoneo per lo sviluppo di metodi immunometrici deve avere una Keq > M-1 KM-EDTA AgEDTA3- CaEDTA2- FeEDTA2- HgEDTA2- 107 M-1 1010 M-1 1014 M-1 1022 M-1 Complesso Per confronto, si riportano le costanti termodinamiche di alcuni complessi tra uno ione metallico ed EDTA, un legante poliamminocarbossilico, che forma complessi chelati molto stabili con numerosi ioni metallici EDTA: acido etilendiaminotetracetico

METODI IMMUNOMETRICI: STORIA
1942 Coons descrive la procedura per marcare un anticorpo con fluorescina. 1959 Berson e Yalow descrivono il primo RIA (RadioImmunoAssay). Ricevono il Premio Nobel in medicina nel 1977. 1960 Singer e Schick descrivono la procedura per coniugare due proteine senza alterare le loro funzioni biologiche. 1969 Avrameas descrive la procedura per coniugare un anticorpo con l’enzima perossidasi utilizzando il metodo della glutaraldeide. 1969 Miles e Hales dimostrano che un enzima può essere utilizzato come marcatore, in alternativa ai radioisotopi, per lo sviluppo di metodi immunoenzimatici (Enzyme ImmunoAssay, EIA). 1971 Engvall e Perlmann descrivono l’ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) nel quale l’analita ed il tracciante (analita coniugato con un enzima) competono per gli anticorpi immobilizzati su una fase solida. La separazione tra fase libera e fase legata avviene mediante lavaggio della fase solida. 1972 Rubenstein descrive il primo EIA omogeneo (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique, EMIT). 1975 Köhler e Milstein descrivono la procedura per produrre anticorpi monoclonali. Ricevono il Premio Nobel in medicina nel 1984.

CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI (I)
Caratteristiche fondamentali di un anticorpo sono l’affinità (misurata in termini chimico-fisici dalla costante di equilibrio K) e la specificità (capacità di riconoscere l’analita, distinguendolo da molecole a struttura simile).Gli anticorpi più comunemente utilizzati per lo sviluppo di metodi immunometrici sono le immunoglobuline G (IgG). La molecola, a forma di “Y”, è composta da due catene aminoacidiche leggere e due pesanti, unite da ponti disolfuro. La regione variabile Fab, che contiene gli N- terminali delle 4 catene, è responsabile del legame altamente specifico con l’antigene, quella costante Fc, che contiene i C-terminali, è specie specifica. legame Ag sito legame Ag sito variabile costante catena leggera catena pesante

CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI (II)
Ponti disolfuro catena L catena H Digestione con Papaina Digestione con Pepsina Riduzione con Mercaptoetanolo frammenti Fc Fab Fc F(ab’)2 Sono stati messi a punto diversi protocolli di digestione delle IgG che permettono di ottenere specifiche porzioni della immunoglobulina.

CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI (III)
In dettaglio è mostrata la porzione Fab dell’anticorpo, con il sito di legame con l’antigene. Si può vedere come in questa porzione dell’anticorpo, perfettamente complementare all’antigene, siano presenti dei gruppi funzionali che stabiliscono numerose interazioni con l’antigene. epitopo paratopo CDR antigene ponte disolfuro intracatena ponte disolfuro intercatena frammento Fab frammento Fc Catena H Catena L

CLASSI DI IMMUNOGLOBULINE
IgG - anticorpi che tendono a durare molto a lungo, anche tutta la vita; IgM - durano poco tempo, e indicano un contatto recente con l'antigene; IgA - non si misurano nel sangue, ma sono presenti sulla superficie di alcuni organi, come per esempio gli alveoli polmonari; IgD - presenti sulla superficie dei linfociti B maturi; IgE - immunoglobuline che intervengono nei processi che regolano le reazioni allergiche (ipersensibilità nei confronti di vari antigeni, alimentari, ambientali, ecc.). macrofago Antigene T-dipendente T linfocita B IgM IgE IgG B linfocita T-indipendente

INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO (I)
L’interazione antigene-anticorpo interessa porzioni limitate delle due molecole. Essa tuttavia si stabilisce su un’area relativamente estesa, attraverso la formazione di numerose interazioni deboli che nel complesso determinano un legame molto stabile. Antigene Anticorpo

INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO (II)
Il legame antigene-anticorpo si forma inizialmente grazie a ponti ad idrogeno, che agiscono a lunga distanza (10 nm). Le molecole di acqua riempiono gli spazi tra antigene ed anticorpo, creando nuovi ponti ad idrogeno e contribuendo a rafforzare il legame. Successivamente si stabiliscono numerose altre interazioni deboli, tipo forze di van der Waals, forze elettrostatiche ed interazioni idrofobiche. Queste interazioni si stabiliscono su un’ampia regione, per cui il legame risulta complessivamente molto stabile. ANTIGENE ANTICORPO Ponti idrogeno Legami ionici Interazioni idrofobiche di Van der Waals Legami ionici

INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO (III)
Forze non covalenti Forze elettrostatiche Legami idrogeno Forze di Van der Waals Forze idrofobiche Origine Attrazione tra cariche opposte Lo ioni idrogeno condiviso tra gruppi diversi crea parziali cariche opposte Le fluttuazioni delle nuvole elettroniche attorno alle molecole generano polarità opposte su atomi vicini I gruppi idrofobici interagiscono sfavorevol-mente con l’acqua e tendono a raggrupparsi insieme per escludere le molecole di acqua. L’attrazione coinvolge anche forze di Van der Waals

MOLECULAR IMPRINTED POLYMERS POLIMERI “SARTORIALI” (I)
I polimeri sartoriali rappresentano un tentativo di costruire in laboratorio una molecola con le caratteristiche di avidità e selettività degli anticorpi naturali, ma più stabili in condizioni non fisiologiche e disponibili in quantità illimitata. Si tratta di polimeri con tasche di legame selettive per l’analita. Essi sono preparati mediante un processo di polimerizzazione, nel quale l’analita viene utilizzato come stampo. I polimeri sartoriali sono stati utilizzati per diverse applicazioni: metodi immunometrici, fasi stazionarie per cromatografia di affinità ed estrazioni in fase solida, sensori, catalisi, ecc..

MOLECULAR IMPRINTED POLYMERS POLIMERI “SARTORIALI” (II)
Sintesi: l’analita viene miscelato con uno o più monomeri funzionali. In opportune condizioni si forma un complesso stabile di pre-polimerizzazione, che può essere basato su interazioni di tipo covalente oppure non covalente. Il primo approccio è applicabile ad un numero ristretto di analiti, mentre il secondo è più flessibile. La scelta dei monomeri è critica per l’ottenimento di un polimero in grado di legare con buona selettività ed affinità l’analita. analita monomeri funzionali cross-linker complesso di pre-polimerizzazione analita-monomeri

MOLECULAR IMPRINTED POLYMERS POLIMERI “SARTORIALI” (III)
Successivamente, si inizia la polimerizzazione, che avviene grazie alla presenza di un cross-linker. Anche la scelta del cross-linker e del solvente nel quale far avvenire la polimerizzazione è critica per l’ottenimento di un polimero con le caratteristiche morfologiche e meccaniche migliori. Il polimero viene poi triturato e setacciato per ottenere particelle del diametro desiderato. Infine l’analita viene rimosso. Nel polimero rimangono delle tasche, le quali, per dimensioni, forma ed orientamento di gruppi funzionali, sono in grado di alloggiare selettivamente l’analita.

MOLECULAR IMPRINTED POLYMERS POLIMERI “SARTORIALI” (IV)
Vantaggi: Avidità e selettività di legame confrontabili con quelle degli anticorpi; Elevata stabilità fisica (stress meccanici, temperature e pressioni elevate) e chimica (acidi, basi, solventi organici); Disponibili in quantità illimitate e stabili per lunghi periodi di conservazione; Possibilità di utilizzare le particelle per impaccare delle colonne per cromatografia di affinità.

MOLECULAR IMPRINTED POLYMERS POLIMERI “SARTORIALI” (V)
Svantaggi: poiché sono preparati in un solvente organico, il legame con l’analita è ottimale in ambiente organico, non in un fluido biologico; è molto difficile stabilire a priori quali siano il monomero, il cross-linker, il solvente e le condizioni di polimerizzazione più adatti per un determinato analita; il processo di triturazione e setacciatura per ottenere particelle di polimero nell’intervallo dimensionale desiderato è lungo e laborioso e comporta una grossa perdita di polimero (circa 50%); la rimozione dell’analita dopo la polimerizzazione non è completa.

COME SI OTTIENE UN ANTICORPO
Un anticorpo specifico per l’analita si ottiene immunizzando un animale da laboratorio con l’analita stesso. L’analita è in grado di stimolare una risposta immunitaria, quindi la produzione di anticorpi solo se ha una massa relativamente elevata (PM > 1000 Da) e in questo caso viene chiamato antigene, altrimenti deve essere coniugato con una macromolecola. La regione di antigene che si trova in contatto diretto con l’anticorpo è detta epitopo o determinante antigenico. L’antigene viene somministrato Dal siero dell’animale si possono purificare le IgG totali (ricche in IgG anti-antigene somministrato)

ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI (I)
Poiché su un antigene sono presenti numerosi epitopi, mediante l’immunizzazione di un animale da laboratorio si ottiene un antisiero contenente una popolazione eterogenea di anticorpi, diretti verso i diversi epitopi dell’antigene e caratterizzati da diverse affinità. Questi anticorpi sono detti policlonali. È possibile ottenere anticorpi monoclonali, cioè una popolazione omogenea di anticorpi diretti verso un unico epitopo. Per questo occorre, dopo avere immunizzato il topo, isolare i diversi cloni di cellule B e testarli per individuare l’anticorpo migliore. Poiché le cellule B normalmente non crescono in coltura, esse devono essere fuse con cellule di mieloma per ottenere ibridomi in grado sia di crescere in coltura sia di produrre quantità illimitate di anticorpo.

PRODUZIONE DI ANTICORPI MONOCLONALI

ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI (II)
IBRIDOMA: mantiene la capacità della cellule della milza di produrre anticorpi, associata alla vitalità della cellule di mieloma. Antisiero policlonale Anticorpi monoclonali

CARATTERISTICHE DEGLI ANTICORPI MONOCLONALI
Vantaggi Svantaggi Caratteriestiche (affinità e specificità) note e costanti Potrebbero essere troppo specifici: (difficoltà nel legare forme diverse dell’antigene) Sono sufficienti piccole quantità di antigene, anche impuro, per la loro produzione Tecniche di produzione più sofisticate E’ possibile selezionare l’anticorpo con la specificità desiderata Non sempre reagiscono con la proteina A Può essere prodotto in quantità illimitata ed è semplice da purificare Non formano precipitato in seguito al legame con l’antigene Solitamente caratterizzati da elevata specificità Spesso caratterizzati da bassa affinità

ANTIGENI ED APTENI Sintesi derivato aptene braccio spaziatore aptene
carrier + a) Un aptene è una molecola rigida e di piccole dimensioni (PM compreso tra 80 e 1000 Da) che può stimolare la produzione di anticorpi SOLO se accoppiata ad una proteina “carrier”, che ne aumenta la massa complessiva. In questo caso, tuttavia, si ottiene una miscela di anticorpi, non tutti diretti contro l’aptene. Anche isolando un anticorpo monoclonale, è necessario accertare che l’anticorpo sia diretto proprio contro l’aptene. anticorpi che riconoscono una parte di aptene ed una parte di braccio spaziatore anticorpi che riconoscono il carrier anticorpi che riconoscono l’aptene

ANTIGENI ED APTENI Esempio: reattività crociata di un anticorpo anti-benzo(a)pirene (BaP) verso altri idrocarburi policiclici aromatici naphtalene antracene fenantrene acenaphtene acenaphtylene fluorene pyrene crysene Benzo[a]anthracene Benzo[a]pyrene dibenzo[a,h]anthracene fluorantene Benzo[e]pyrene Benzo[k]fluoranthene Benzo[b]fluorantene Indeno[1,2,3cd]pyrene Benzo[g,h,i]perylene

Specificità e struttura immunogeno
Una caratteristica fondamentale dell’anticorpo è la sua specificità (capacità di legare selettivamente l’analita, distinguendolo da altre molecole di struttura simile). Si definisce reattività crociata la tendenza dell’anticorpo a legare gli interferenti. 100% 40% Posizione e tipo di derivato utilizzato per la produzione dell’anticorpo Scarsa specificità per mancanza anche dell’anello aromatico L’anticorpo è molto specifico per il BaP e gli altri IPA non interferiscono Segnale [BaP μg/L

Tipo di derivato e specificità dell’Anticorpo
Esempio: 17β-Estradiolo aptene C17 C16 estrone proteina Braccio spaziatore proteina estriolo

SPECIFICITA’ DEGLI ANTICORPI (II)
Esempio: produzione di un anticorpo anti-estradiolo. La reattività crociata verso altri ormoni steroidei varia in funzione della posizione di derivatizzazione dell’aptene scelta per la sintesi dell’immunogeno. estriolo estrone C17 estradiolo 3,8  1,2 % 5,6  2,0 % 48  8 % Reattività crociata 40  10 % 5,0  1,8 % 0,48  0,27 % estrone estriolo C6 C16 C17 Derivatizzazione C16 C6

Ү Ү Metodi immunologici per ioni metallici Me + EDTA Me + GSH
Si produce un anticorpo contro un chelate metal-ion -protein: per esempio Me-EDTA-BSA L’anticorpo non riconosce il metallo ma l’intero complesso Me-EDTA Me Ү Me + EDTA proteina GSH Me Ү Si produce un anticorpo contro un complesso Me-Proteina o Me-Molecola organica: Il GSH , i suoi gruppi tiolici liberi legano fortemente il Hg(II).L’Anticorpo riconosce il complesso Me-GSH Me + GSH proteina

INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO ASPETTI TERMODINAMICI
Il legame tra analita (An) ed anticorpo (Ab) può essere descritto dall’equilibrio: Ab An + An-Ab ka kd Keq = [An-Ab]eq [An]eq [Ab]eq ka kd = dove An-Ab è il complesso analita-anticorpo, ka e kd sono le costanti di velocità di associazione e dissociazione del complesso e Keq è la costante di equilibrio del processo ed è una misura dell’affinità dell’anticorpo per l’analita, cioè della forza del legame An-Ab. L’unità di misura per Keq è L mol-1. Anticorpi con Keq  L mol-1 sono adatti per lo sviluppo di metodi immunometrici.

= Keq Abt - Keq [An-Ab]eq
SCATCHARD PLOT (I) L’affinità dell’anticorpo per l’analita può essere determinata graficamente mediante diagramma di Scatchard. Sperimentalmente, occorre incubare quantità crescenti di analita con una quantità fissa di anticorpo e misurare all’equilibrio la concentrazione dell’ analita libero e quella dell’antigene legato. Riprendendo l’equazione: Keq = [An-Ab]eq [An]eq [Ab]eq ka kd = si definisce Abt = [Ab]eq + [An-Ab]eq (concentrazione totale di anticorpo). Riarrangiando l’equazione ed introducendo Abt si ottiene: [An-Ab]eq [An]eq = Keq Abt - Keq [An-Ab]eq

= Keq Abt - Keq [An-Ab]eq
SCATCHARD PLOT (II) [An-Ab]eq [An]eq = Keq Abt - Keq [An-Ab]eq Rappresentando [An-Ab]/[An] (rapporto tra analita legato ed analita libero, cioè bound/free) rispetto ad [An-Ab] (bound) si ottiene un diagramma di Scatchard, dove la pendenza è – Keq, l’intercetta sull’asse y è KeqAbt e l’intercetta sull’asse x è Abt.

SCATCHARD PLOT (III) Il diagramma di Scatchard corrispondente ad un anticorpo monoclonale è una retta, dove: pendenza = - Keq intercetta sull’asse x = Abt. Keq Il diagramma di Scatchard corrispondente ad un anticorpo policlonale, cioè una classe eterogenea di anticorpi con diversa Keq, è curvilineo, in quanto deriva dalla sovrapposizione di di-versi processi di associa-zione antigene-anticorpo, ciascuno caratterizzato dalla propria Keq. Per questo sistema si può calcolare una K apparente. High affinity Abt Low affinity

EFFETTI DELL’ETEROGENEITA’ DELL’ANTICORPO
SCATCHARD PLOT (IV) EFFETTI DELL’ETEROGENEITA’ DELL’ANTICORPO Per un diagramma di Scatchard curvilineo si possono individuare le rette corrispondenti alla Keq massima ed alla Keq minima. La retta 1 viene estrapolata per [An-Ab]eq che tende a zero. La retta 2 viene estrapolata per [An-Ab]/[An]eq che tende a zero. [An-Ab] [An-Ab]/[An] Retta 1 Retta 2 La Keq massima a minima danno informazioni sull’anticorpo: eterogeneità (differenza tra le due Keq); specificità (gli anticorpi con Keq vicina alla Keq minima sono quelli con minore specificità e si possono cercare strategie per minimizzare il loro effetto).

La formazione del complesso An-Ab non è sempre direttamente misurabile
TRACCIANTI (I) La formazione del complesso An-Ab non è sempre direttamente misurabile En + S EnS En + P L’interazione enzima-substrato si autorivela attraverso la formazione del prodotto o scomparsa del substrato che hanno proprietà chimiche diverse An + Ab An-Ab La reazione è difficilmente rivelabile se non sfruttando le diverse proprietà fisiche del complesso An-Ab rispetto ad An libero Per esempio: differenze di massa misurabili con biosensori piezoelettrici o diverse proprietà ottiche misurabili con il sistema Biacore E’ più pratico utilizzare un tracciante cioè un reattivo che, partecipando alla reazione An-Ab in opportune condizioni, ne permetta la rivelazione sensibile

TRACCIANTI (II) La formazione del complesso An-Ab viene solitamente misurata sfruttando un approccio indiretto, introducendo un tracciante, legato all’antigene o all’anticorpo, che partecipando alla reazione immunologica, la evidenzia con alta rivelabilità. 1 2 3 tracciante analita aggiunta reattivi Conc. analita Tracciante legato 4 16 2 1 reazione separazione libero legato

TRACCIANTI (III) Il tracciante deve essere una molecola caratterizzata da un elevato rapporto segnale/massa. Questo permette di ottenere un segnale altamente rivelabile anche in presenza di piccole quantità di tracciante, quindi di fare avvenire la competizione in presenza di poche molecole, abbassando il limite di rivelazione del metodo. Tra le molecole facilmente rivelabili si può utilizzare: un radioisotopo (radioimmunoassay, RIA) un enzima (enzyme immunoassay, EIA) un substrato enzimatico un coenzima o un inibitore enzimatico una molecola fluorescente o un quencher

SCELTA DEL TRACCIANTE (I)
Amplificazione enzimatica: 1 molecola di enzima 1000 molecole di prodotto Aumenta con: - attività enzimatica - rivelabilità del prodotto - amplificazione ciclica Luminescenza Analita—Enzima Substrato Prodotto Fotometria Fluorescenza Analita—125I emissione  1 disintegrazione/sec molecole (106) Analita—Chemilum. Reaz. chimica Ic h Ic aumenta con: cl (resa quantica) f (rapporto molecole chemilum/analita) Ic = f ccl cl Analita—Fluoroforo I0 h If h’ If aumenta con: I0 (intensità del raggio di eccitazione)  (coefficiente di estinzione) c (concentrazione) If = I0  F cd

SCELTA DEL TRACCIANTE (II) TRACCIANTE: LIMITE DI RIVELAZIONE
Il tracciante deve essere presente nel tubo ad una massa estremamente bassa ( g) e facilmente rivelabile 10-16 – 10-18 I emissione Molecola chemiluminescente 10-15 – 10-16 I fluorescente Molecola fluorescente 10-20 – 10-21 Amplificazione ciclica enzimatica 10-15 – 10-18 Fluorescenza Luminescenza Assorbanza Enzima 0.1 – 10 x 10-15 ≈ dpm 125I MASSA (moli/tubo) SEGNALE TRACCIANTE

SCELTA DEL TRACCIANTE (III)
TRACCIANTI LUMINESCENTI 10-20 moli (Bronstein et al. 1989) Fosfatasi alcalina/ adamantil-1,2-diossietano-fenil-fosfato 10-18 moli (Tsuji et al. 1986) Glucosio 6-fosfato deidrogenasi / perossidasi / isoluminolo < moli (Kricka et al. 1987) 8x10-17 moli (Motsenbocker 1988) Perossidasi / luminolo / enhancer Enzima: chemiluminescenza 10-13 moli (Woodhead et al. 1982) Fluorescina 2x10-17 moli (Soini e Kojola 1983) Ioni europio (III) Fluorescenza 10-19 moli (Geiger e Miska 1987) 10-19 moli (Tanaka e Ishikawa 1986) Luc / luciferina con amplificazione enzimatica 5.6x1016 fotoni/min/mg luciferasi (attività specifica) (Wulff et al. 1982) moli (Schram et al. 1981) Luciferasi da lucciola (Luc) / luciferina Bioluminescenza Limite di rivelazione Esempi Tipo di tracciante

METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA) (I)
Perché è vantaggioso utilizzare un enzima come marcatore per la sintesi di un tracciante? L’attività catalitica dell’enzima permette di amplificare il segnale analitico (un solo enzima genera moltissime molecole di prodotto). Il limite di rivelazione del metodo è quindi significativamente inferiore rispetto ai metodi basati sull’uso di substrati enzimatici o molecole fluorescenti o chemiluminescenti come marcatori. S E La molecola di substrato utilizzata come marcatore produce una sola molecola di prodotto per ogni molecola di tracciante L’enzima utilizzato come marcatore produce molte molecole di prodotto per ogni molecola di tracciante

METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA) (II)
Perché è possibile utilizzare un enzima come marcatore? E’ lecito chiedersi se un piccolo aptene (0,3-1 kDa) chimicamente legato ad un enzima ( kDa), non sia impedito nel legame all’anticorpo a causa di un forte ingombro sterico. Tuttavia, visto che l’anticorpo è stato prodotto utilizzando come immunogeno l’aptene coniugato con una proteina carrier ( kDa), è molto probabile che gli anticorpi riescano a legare l’aptene anche nella molecola di tracciante. La sintesi dell’immunogeno viene eseguita in modo da ottenere un elevato rapporto di coniugazione aptene/proteina e quindi esporre numerose molecole di aptene sulla superficie dell’immunogeno; la sintesi del tracciante enzimatico viene condotta in modo da ottenere un basso rapporto di coniugazione aptene/proteina e quindi un elevato rapporto segnale/massa, che produce un limite di rivelazione del metodo più basso. E

METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA) (III)
Un enzima ideale per lo sviluppo di un EIA deve essere: sufficientemente stabile nel tempo nelle condizioni di conservazione sufficientemente attivo dopo la coniugazione con l’antigene o l’anticorpo e nelle condizioni sperimentali di esecuzione dell’EIA. Un parametro estremamamente importante è l’attività specifica dell’enzima (attività per unità di peso dell’enzima), che generalmente si esprime in unità per mg (U/mg).

METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA) (IV)
Vantaggi relativi all’uso di enzimi: sono facilmente reperibili in forma pura, relativamente economici e stabili; sono disponibili numerose metodiche semplici ed automatizzabili per la misura dell’attività enzimatica; una molecola di enzima può produrre moltissime molecole di prodotto; è possibile ottenere la modulazione dell’attività enzimatica in seguito al legame con l’anticorpo, permettendo lo sviluppo di EIA omogenei. Svantaggi relativi all’uso di enzimi: l’attività enzimatica può variare in funzione della temperatura o della presenza di interferenti; la coniugazione chimica dell’enzima può ridurne l’attività specifica; si può avere rumore di fondo dovuto alla presenza di enzima nel campione.

MISURA DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA (I)
L’attività enzimatica viene misurata valutando la velocità della reazione enzimatica in condizioni di eccesso di substrato. Si può scegliere di misurare la velocità di scomparsa del substrato o quella di comparsa del prodotto. Il secondo metodo è preferibile poiché la misura è più accurata (ad es. da 0 a 1% per la comparsa del prodotto, da 100% a 99% per la scomparsa del substrato), soprattutto considerando che occorre lavorare in condizioni di eccesso di substrato. La velocità di una reazione enzimatica si esprime come quantità di substrato trasformato nell’unità di tempo. La misura del prodotto della reazione enzimatica è proporzionale alla concentrazione dell’enzima se: - l’andamento della reazione è lineare nel tempo - l’attività enzimatica è proporzionale alla quantità assoluta di enzima.

MISURA DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA (II)
Tempo μmol di prodotto formato x nmol di enzima 2x nmol di enzima 4x nmol di enzima 10 min 20 min 90 170 250 La comparsa del prodotto in un tempo lungo (10 o 20 minuti) non è proporzionale alla quantità di enzima. Occorre quindi considerare la velocità iniziale della reazione.

MISURA DELL’ATTIVITA’ ENZIMATICA (III)
Secondo l’equazione di Michaelis-Menten: V velocità della reazione Vmax velocità massima della reazione (enzima saturato dal substrato) [S] concentrazione del substrato Km costante di Michaelis-Menten Se [S] >> Km, ne consegue che V = Vmax, quindi: tempo prodotto 1 2 3 Quantità di enzima velocità iniziale della reazione 3 2 1

TRACCIANTI ENZIMATICI
Luminescenza 2-naphthyl--D-galactopyranoside Fluorimetria 4-metilumbelliferone Fotometria 2-nitrofenolo -galattosidasi AMPPD 4-metilumbelliferone-fosfato 4-nitrofenilfosfato Fosfatasi alcalina H2O2/luminolo H2O2/cromogeno Perossidasi METODOLOGIA ANALITICA SISTEMA DI RIVELAZIONE ENZIMA La misura dell’attività enzimatica viene comunemente effettuata utilizzando un substrato che viene trasformato dall’enzima in prodotto colorato, il quale viene poi misurato tramite fotometria. L’uso di substrati fluorescenti o luminescenti permette di ridurre il limite di rivelazione del metodo.

I0 I A b c FOTOMETRIA (I) SUBSTRATO
ENZIMA SUBSTRATO PRODOTTO L’enzima trasforma il substrato incolore in un prodotto colorato, cioè capace di assorbire la luce nel visibile. I0 I b c A

2,3-diamminofenazina (DAP)
FOTOMETRIA (II) ENZIMA SUBSTRATO PRODOTTO N H 2 perossidasi H2O2 o-fenilendiammina 2,3-diamminofenazina (DAP) arancio max=492 nm

FLUORESCENZA (I) SUBSTRATO PRODOTTO
Il rendimento quantico di fluorescenza molecolare  è il rapporto tra il numero di molecole che emettono la fluorescenza ed il numero totale di molecole eccitate (o il rapporto tra fotoni emessi e fotoni assorbiti): dove Rf è la velocità di rilassamento fluorescente e Rr è la velocità di rilassamento non-radiativo. ENZIMA SUBSTRATO PRODOTTO L’enzima trasforma il substrato non fluorescente in un prodotto fluorescente. La fluorescenza è un processo di emissione in cui le molecole sono eccitate dall’assorbimento di una radiazione elettromagnetica. Le specie eccitate, successivamente, ritornano allo stato fondamentale emettendo l’energia in eccesso sotto forma di fotoni.

FLUORESCENZA (II) E 1 2 Assorbimento molecolare l 5 Energia ’ Conversione interna Rilassamento vibrazionale Fluorescenza Diagramma energetico parziale di una specie molecolare ipotetica (diagramma di Jablonski)

CHEMILUMINESCENZA (I)
Con il termine chemiluminescenza si indica il fenomeno di conversione di energia chimica in radiazione luminosa, di lunghezza d'onda variabile dall'ultravioletto all'infrarosso comprendendo tutto il campo del visibile. Reagenti Intermedio [ Prodotti ]* Prodotti + hn stadio 1 stadio 2 stadio 3 La specie “Intermedio” deve essere molto ricca di energia, in modo da potersi decomporre formando almeno un prodotto in uno stato eccitato. Siccome le reazioni di ossidazione con l'ossigeno molecolare sono molto esoergoniche, esse sono fra le reazioni chemiluminescenti più comuni.

CHEMILUMINESCENZA (II) fotoni emessi molecole reagenti
L'efficienza di un processo di chemiluminescenza, CL, è definita dalla relazione: fotoni emessi molecole reagenti CL = Se Int = resa dello stadio 1 (formazione dell'Intermedio), SE = resa dello stadio 2 (formazione dei Prodotti nello stato eccitato) Em = resa quantica dello stadio 3 (emissione di fotoni) l' efficienza del processo di chemiluminescenza è: CL = IntSEEm Poiché la resa di ciascuno stadio del processo é minore di 1, la resa quantica dell'intero processo di chemiluminescenza é sicuramente minore di 1. I valori di resa quantica dei più comuni processi di chemiluminescenza in genere non superano il valore 0,1.

CHEMILUMINESCENZA (III)
Ossidazione del luminolo (3-aminoftalidrazide) in ambiente alcalino mediante perossido d’idrogeno o altri agenti ossidanti, quali i perossidi organici. La reazione può essere catalizzata da enzimi quali la perossidasi, la microperossidasi e le catalasi, nonché da altre sostanze quali emoglobina, citocromo c, ione Fe3+ e vari complessi di metalli di transizione. Il prodotto di ossidazione del luminolo é l'anione amminoftalato nello stato eccitato, che é responsabile dell’emissione (max = 420 nm). L'utilizzo di "enhancer" quali il p-iodofenolo ha permesso di aumentare l’intensità del segnale di alcuni ordini di grandezza e di ottenere una cinetica di emissione più lenta e stabile nel tempo.

CHEMILUMINESCENZA (IV)
La reazione del luminolo può essere utilizzata per la misura dell’attività del tracciante enzimatico perossidasi, operando in eccesso di substrato. In alternativa, è possibile utilizzare il luminolo come tracciante. Sono stati sintetizzati derivati isoluminolo-antigene o isoluminolo-anticorpo. Biotina-isoluminolo Proteina-isoluminolo Generalmente è preferibile utilizzare l’enzima come marcatore, ottenendo così: l’amplificazione del segnale una cinetica di emissione caratterizzata da uno stato stazionario.

CHEMILUMINESCENZA (V)
Decomposizione dell'adamantil-1,2-diossietano-fenil-fosfato (AMPPD) catalizzata dall'enzima fosfatasi alcalina (AP) in ambiente acquoso. L'AMPPD, che contiene un anello di tipo diossietano, viene defosforilato in presenza dell'enzima. Il prodotto della reazione si scinde in due frammenti carbonilici, uno dei quali é in uno stato eccitato e può dare luogo a luminescenza.

CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI (I)
I metodi immunometrici possono essere classificati in: segnale log concentrazione analita Competitivi (a modulazione di attività, AM). Si basano sulla modulazione del segnale analitico dovuta alla competizione tra le molecole di analita e quelle del tracciante per un numero limitato di siti anticorpali. Il segnale analitico diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita presente nel campione, la curva dose-risposta ha forma sigmoidale. segnale concentrazione analita Non competitivi (ad amplificazione di attività, AA), tutto l’analita presente nel campione viene catturato dall’anticorpo in eccesso e rivelato. Il segnale analitico è direttamente proporzionale alla concentrazione di analita nel campione, la curva dose-risposta è lineare.

CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI (II)
I metodi immunometrici possono essere distinti in: Eterogenei (su fase solida). Il metodo di rivelazione non permette di distinguere tra tracciante legato all’anticorpo e tracciante libero. Questi metodi necessitano di una separazione della frazione libera da quella legata prima della misura, quindi prevedono l’immobilizzazione di un componente (antigene o anticorpo) su una fase solida; in alternativa si può procedere mediante precipitazione del complesso antigene-anticorpo utilizzando glicole polietilenico o un secondo anticorpo in eccesso. Omogenei. Il legame del tracciante all’anticorpo ne modula (aumenta o riduce) l’attività. Questi metodi non necessitano della separazione della frazione libera da quella legata e quindi sono eseguiti in fase liquida.

CLASSIFICAZIONE DEI METODI IMMUNOMETRICI (III)
CARATTERISTICHE DEI METODI OMOGENEI ED ETEROGENEI Metodi eterogenei Poco sensibile all’interferenza della matrice del campione Molto sensibile all’interferenza della matrice del campione Ampio ambito dinamico del metodo Ambito dinamico del metodo inferiore Bassi limiti di rivelazione Limiti di rivelazione più elevati Difficili da automatizzare Possono essere automatizzati facilmente Esecuzione del metodo più complicata Esecuzione semplice e rapida Metodi omogenei

Fisica (adsorbimento)
METODI ETEROGENEI (I) IMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (I) Chimica Fisica (adsorbimento) IgG anti-analita da coniglio IgG anti-coniglio (Fc specifico) da capra Biotina-avidina Proteina A Anticorpo

METODI ETEROGENEI (II) Fisica (adsorbimento)
IMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (II) ADSORBIMENTO FISICO L’adsorbimento passivo dell’anticorpo sulla fase solida avviene mediante interazioni idrofobiche. Il processo è influenzato da: pH (deve essere vicino al punto isoelettrico dell’anticorpo, in modo che la carica elettrica della molecola Fisica (adsorbimento) tenda a zero); forza ionica (la presenza di sali, che neutralizzano le cariche elettriche, favorisce le interazioni idrofobiche); temperatura (l’aumento della temperatura favorisce la diffusione, quindi rende il processo più rapido); tempo (in genere qualche ora è sufficiente, a temperatura ambiente); concentrazione proteica (se è troppo elevata si formano strati proteici multipli, con conseguente ridotta capacità legante e stabilità, se è troppo bassa si osservano interazioni aspecifiche dell’antigene con la fase solida, le quali tuttavia possono essere notevolmente ridotte saturando la superficie libera del tubo con una proteina (BSA) o un polimero (PVP).

METODI ETEROGENEI (III)
METODI DI IMMOBILIZZAZIONE DI UN ANTICORPO SU POLISTIRENE Proteine legate mg/sfera Aspecifici % Riproducibilità mediaDS Capacità legante polistirene 1.5 < 2 800  68 50-60 idrazide 2.6 14 700  150 25-30 alchilammina 2.8 15 860  165 28-38

METODI ETEROGENEI (III)
IMMOBILIZZAZIONE DELL’ANTICORPO SU FASE SOLIDA (III) MEDIANTE ANTICORPO Anticorpi di cattura Fc specifici Anticorpi di cattura Fab specifici Gli anticorpi anti-analita sono orientati in maniera ottimale per legare l’antigene Gli anticorpi anti-analita non sono in grado di legare l’antigene

METODI ETEROGENEI COMPETITIVI (I)
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTI Aggiunta del campione Antigene Enzima Aggiunta del tracciante Tracciante Incubazione Substrato enzimatico Anticorpo immobilizzato Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida

METODI ETEROGENEI COMPETITIVI (II)
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) DIRETTI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI ETEROGENEI COMPETITIVI (III)

METODI ETEROGENEI COMPETITIVI (IV)

METODI ETEROGENEI COMPETITIVI (V)

METODI ETEROGENEI COMPETITIVI (VI)

METODI ETEROGENEI COMPETITIVI (VII)

METODI ETEROGENEI COMPETITIVI (VIII)
Metodo immunometrico competitivo eterogeneo: il legame dell’analita all’anticorpo viene rivelato indirettamente attraverso la misura del legame del tracciante all’anticorpo. 1 2 3 tracciante analita aggiunta reattivi Conc. analita Tracciante legato 4 16 2 1 reazione separazione libero legato

METODI ETEROGENEI COMPETITIVI (VIII)
ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) INDIRETTI E Aggiunta antigene e anticorpo Aggiunta dell’anticorpo marcato Substrato Segnale Competizione per il sito anticorpale Separazione Misura dell’attività enzimatica Anticorpoanti-IgG marcato Analita immobilizzato Anticorpo anti-analita Analita libero E

SISTEMI OMOLOGHI ED ETEROLOGHI (I)
Per sviluppare un metodo competitivo per un aptene occorre coniugare l’aptene: ad una proteina carrier per la produzione dell’immunogeno ad un enzima per la produzione del tracciante. Occorre quindi sintetizzare un derivato dell’aptene, in modo da: introdurre nell’aptene un gruppo reattivo in grado di reagire con le proteine introdurre il gruppo reattivo sull’aptene al termine di un braccio spaziatore, in modo che l’aptene venga poi inserito ad una certa distanza dalla superficie della proteina e possa liberamente essere riconosciuto e legato dall’anticorpo.

SISTEMI OMOLOGHI ED ETEROLOGHI (II)
Nei sistemi omologhi lo stesso derivato dell’aptene viene utilizzato per la sintesi dell’immunogeno e del tracciante. Nei sistemi eterologhi immunogeno e tracciante sono sintetizzati utilizzando: due apteni simili ma non identici, con lo stesso ponte inserito nella stessa posizione (eterologia di aptene); lo stesso aptene, ma con un diverso ponte che unisce l’aptene alla proteina (eterologia di ponte); lo stesso aptene e lo stesso ponte, ma inserito in una posizione differente dell’aptene (eterologia di posizione). I sistemi eterologhi permettono di ottenere anticorpi con affinità maggiore per l’analita rispetto al tracciante, quindi di migliorare il limite di rivelazione del metodo.

METODI OMOGENEI COMPETITIVI (I)
EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (I) Metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando traccianti enzimatici che, in seguito al legame con l’anticorpo, mostravano una variazione (aumento riduzione) della propria attività catalitica. I primi metodi EMIT sono stati sviluppati utilizzando l’enzima lisozima come tracciante, ma successivamente l’enzima glucosio-6-fosfato deidrogenasi NAD dipendente (G6PD) è stato ampiamente utilizzato, grazie alla sua maggior capacità di modulare la propria attività catalitica in seguito all’interazione con l’anticorpo.

EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (II) Sono stati proposti due sistemi. 1° sistema: Il tracciante in soluzione è attivo Diventa inattivo dopo legame con l’anticorpo Il segnale aumenta all’aumentare della concentrazione di analita. S P conc. analita attività enzimatica

EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique) (III) 2° sistema: Il tracciante in soluzione è inattivo Diventa attivo dopo legame con l’anticorpo Il segnale diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita. S P conc. analita attività enzimatica

METODI OMOGENEI COMPETITIVI (II)
Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (I) L’efficienza dell’assorbimento della luce da parte di un fluoroforo dipende dall’angolo tra il dipolo elettronico della luce eccitatrice e l’oscillatore nella molecola. Una luce polarizzata su un piano ecciterà in maniera efficiente solo quelle molecole che hanno i loro oscillatori orientati opportunamente (di solito parallelamente) rispetto al piano della luce eccitatrice. Se il fluoroforo è fermo, la luce emessa sarà parallela a quella assorbita. luce assorbita luce emessa fluoroforo

Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (II) Il grado di polarizzazione della radiazione emessa dipende dal tempo di emivita dello stato eccitato ( ) e dal movimento rotatorio della molecola. Se il tempo richiesto al fluoroforo per ruotare è confrontabile con , esso cambierà posizione prima di emettere fluorescenza e quindi la luce emessa perderà parzialmente o completamente la polarizzazione. fluoroforo fisso fluoroforo libero di ruotare La polarizzazione viene mantenuta La polarizzazione viene persa

Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (III) Per eseguire la misura, il campione viene eccitato alternativamente con luce polarizzata orizzontalmente e verticalmente. Il grado di polarizzazione (P) viene calcolato come: dove: IVV = segnale quando si misura l’emissione sul piano parallelo a quello di eccitazione (si eccita sul piano verticale, si misura sul piano verticale). IHV = segnale quando si misura l’emissione sul piano perpendicolare a quello di eccitazione (si eccita sul piano orizzontale, si misura sul piano verticale).

Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (IV) A valori costanti di  (tempo di emivita dello stato eccitato) il grado di polarizzazione della radiazione emessa dipende solo dal tempo di rilassamento rotazionale della molecola (). = 3vM / RT dove  è la viscosità del mezzo, v è il volume specifico parziale (mL/g) ed M è il peso molecolare del fluoroforo, R è la costante dei gas e T è la temperatura. Maggiore è il peso molecolare del fluoroforo, maggiore sarà il suo tempo di rilassamento rotazionale (~ 4,3 nsec per la fluorescina e ~ 100 nsec per una immunoglobulina).

Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (V) La relazione che lega il grado di polarizzazione (P) al tempo di rilassamento rotazionale della molecola () ed al tempo di emivita dello stato eccitato () è: (1/P – 1/3) = (1/P0 – 1/3)(1 + 3/) dove P0 è il valore di polarizzazione limitante, cioè il massimo grado di polarizzazione che si ottiene quando tutte le molecole sono ferme nello spazio. Combinando questa equazione con la precedente: 1/P = 1P0 + {1/P0 – 1/3} x RT/vM x   Il valore di polarizzazione misurato fornisce quindi una misura diretta delle dimensioni del fluoroforo a temperatura e viscosità costanti.

Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) (VI) Una grossa molecola (anticorpo) ha un tempo di rotazione di circa 100 ns, mentre una piccola molecola (farmaco) di circa 1 ns. Metodi immunometrici competitivi omogenei sono stati sviluppati utilizzando traccianti fluorescenti e sfruttando la possibilità di distinguere tra tracciante libero in soluzione e tracciante legato all’anticorpo mediante misure di fluorescenza polarizzata. Il tracciante legato all’anticorpo mantiene un grado di polarizzazione maggiore rispetto al tracciante libero. Si può quindi ottenere una curva dose-risposta senza la necessità di separare la frazione di tracciante libero da quello legato prima della misura.

METODI OMOGENEI COMPETITIVI (III)
ECIA (Enzyme Channeling Immuno Assay) L’analita compete con il tracciante per i siti anticorpali. L’anticorpo è coniugato ad un enzima. S P1 P2 S P1 Q S P1 In presenza di elevate quantità di analita, il tracciante, che non si lega all’anticorpo, interagisce con un enzima in soluzione che trasforma P1 in un prodotto non misurabile (Q). Questo riduce il segnale di fondo. In presenza di piccole quantità di analita, il tracciante interagisce con l’enzima immobilizzato sull’anticorpo, che trasforma P1 in un prodotto misurabile (P2).

PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI (I)
La misura della quantità di analita An è basata sulla competizione con il tracciante An* per un numero limitato di siti anticorpali (Ab). Riducendo la concentrazione dell’anticorpo e del tracciante è possibile ottenere un limite di rivelazione più basso. Tuttavia, per la legge di azione di massa, a basse concentrazioni di reagenti la velocità di formazione del complesso si riduce, quindi l’accuratezza del metodo sarà inferiore. L’equilibrio che si instaura è: KAn An + Ab An-Ab Le condizioni per l’esecuzione del metodo sono: [An*]i = costante [Ab]i = costante [Ab]i < [An]i + [An*]i + An* KAn* An*-Ab

PRINCIPIO DI FUNZIONAMENTO DEI METODI COMPETITIVI (II)
Per i metodi competitivi, il segnale diminuisce all’aumentare della concentrazione di analita. segnale concentrazione analita segnale log concentrazione analita

PARAMETRI DI OTTIMIZZAZIONE DI UN METODO COMPETITIVO (I)
Ab An + An-Ab Ka Kd Dove: [Ab]eq = concentrazione di anticorpo libero all’equilibrio [An]eq = concentrazione di analita libero all’equilibrio [An-Ab]eq = concentrazione di complesso analita-anticorpo all’equilibrio Si indica con: Abt = concentrazione totale di anticorpo = [Ab]eq + [An-Ab]eq T = concentrazione totale di analita = [An]eq + [An-Ab]eq ovvero = [An]i + [An*]i (dove An è l’analita nel campione e An* è l’analita marcato) R = [An-Ab]eq/T, cioè frazione di analita legato. Questa è la variabile che viene di solito determinata nei metodi immunometrici.

PARAMETRI DI OTTIMIZZAZIONE DI UN METODO COMPETITIVO (II)
si può scrivere come: Keq = [An-Ab]eq [An]eq [Ab]eq (Abt-[An-Ab]eq) (T-[An-Ab]eq) dividendo per T e sapendo che [An-Ab] = RT: R (Abt-RT) (1-R) poiché T = [An]i+[An*]i e riarrangiando: Keq (1<-R) (Abt-R[An]i-R[An*]i) = R R R = 0 ([An]i+[An*]i+Abt+1/K) ([An]i+[An*]i) Abt si ricava l’equazione: che può essere risolta per R (frazione di analita legato) in funzione di [An]i, [An*]i, Abt e K. Se tre di queste variabili sono costanti, è possibile osservare l’effetto della quarta sull’andamento di R.

PARAMETRI DI OTTIMIZZAZIONE DI UN METODO COMPETITIVO (III)
EFFETTI DELLE CARATTERISTICHE DELL’ANTICORPO Una riduzione di Abt sposta la curva a concentrazioni di analita più basse, ma a scapito della sensibilità (confronto tra curve verde e blu). Un aumento di K aumenta la sensibilità (confronto tra curve blu e rossa). K=1010 L mol-1 Abt=10-10M Abt=10-9M K=1011 L mol-1 Concentrazione di antigene nel campione, [An] (M) Curve teoriche di legame per un metodo immunometrico competitivo 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 R, frazione di antigene legato

Una riduzione di An* aumenta la sensibilità del metodo.
PARAMETRI DI OTTIMIZZAZIONE DI UN METODO COMPETITIVO (IV) EFFETTO DELLA VARIAZIONE DELLA CONC. DI TRACCIANTE An* 1,0 An*=0 K=1010Lmol-1 Abt =3X10-10M 0,8 An*=10ng/mL 0,6 R, frazione di antigene legato An*=30ng/mL 0,4 An*=100ng/mL 0,2 10-11 10-10 10-9 10-8 Concentrazione di antigene nel campione, [An] (M) Una riduzione di An* aumenta la sensibilità del metodo.

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI (I)
PROFILO DI IMPRECISIONE RELATIVO AD UNA CURVA DOSE-RISPOSTA SIGMOIDALE, OTTENUTO ASSUMENDO ASSENZA DI ERRORE DI INTERPOLAZIONE E COSTANZA DI ERRORE DI RISPOSTA (10%) DyA DyB DyC DxA DxB DxC xA xB xC Dy = ±10% RISPOSTA DOSE

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI (II)
SPECIFICITA’ DELL’INTERAZIONE ANTIGENE-ANTICORPO Le reazioni analita-anticorpo sono caratterizzate da elevata specificità, definita come la capacità dell’anticorpo di legare selettivamente l’analita e non altre specie (interferenti) simili. La specificità dell’anticorpo non è sempre assoluta. Si definisce reattività crociata la sua tendenza a legare gli interferenti. Tra i vari modi per misurarla, quello più usato è la misura del rapporto percentuale tra la concentrazione di analita che spiazza il 50% di tracciante dall’anticorpo e la concentrazione di interferente che produce lo stesso effetto. 50 100 [An] a b [An-Ab]/[An]

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI (III)
La concentrazione dell’analita nel campione viene determinata per interpolazione su una curva-dose risposta prodotta in parallelo utilizzando degli standard. La curva viene prodotta rappresentando B/B0 (rapporto tra segnale dello standard a concentrazione x e segnale ottenuto a dose zero di analita) in funzione del logaritmo della concentrazione di analita. B0 è il segnale ottenuto in assenza di analita, cioè rappresenta il legame massimo del tracciante alla fase solida. B è il segnale a concentrazione x di analita (solo una frazione di tracciante è legato alla fase solida). B/B0 rappresenta quindi la frazione di tracciante che è stato spiazzato in presenza della concentrazione x di analita ed è compreso tra 0 e 1. B/B0 log concentrazione analita

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI (IV)
c a a/2 y x b = fattore di pendenza(*) FUNZIONE LOGISTICA A TRE PARAMETRI x = dose y = B-N a+d 2 d x = dose y = B L’introduzione del quarto parametro d (risposta a dose infinita) rende inutile la sottrazione del segnale di fondo N FUNZIONE LOGISTICA A QUATTRO PARAMETRI (*) il fattore di pendenza si riferisce alla linearizzazione logit-log

TRASFORMAZIONE LOGIT/LOG
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI (V) LINEARIZZAZIONE DELLA CURVA DOSE-RISPOSTA DI UN METODO COMPETITIVO TRASFORMAZIONE LOGIT/LOG La trasformazione logit/log consiste nello “stiramento” della sigmoide che approssima la curva dose-risposta in uno spazio semilogaritmico e permette di linearizzare la porzione centrale della curva.

METODI NON COMPETITIVI
Si utilizza un notevole eccesso di immunoreattivo in modo da ottenere il massimo segnale dall’analita. Per la legge di massa la velocità di formazione del complesso antigene-anticorpo è proporzionale alla concentrazione dei reattivi. Ciò implica che anche a bassissima concentrazione di analita un’alta frazione reagirà con l’anticorpo in eccesso. Segnale Concentrazione analita La curva dose-risposta ha un andamento lineare ed il segnale è direttamente proporzionale alla con-centrazione di analita.

METODI NON COMPETITIVI
Non Competitivi di Tipo “Sandwich”: rappresentano il tipo più diffuso di metodi non competitivi eterogenei Reazione dell’analita (Ag) presente nel campione con un eccesso di anticorpo di cattura (Ab) e, successivamente, con un eccesso di tracciante (anticorpo di rivelazione marcato, Ab*) [Ab] > [Ag] [Ab*] > [Ag] L’analita deve essere una molecola relativamente grande, in grado di legare contemporaneamente due anticorpi Eterogenei: separazione fisica tra Ab* e Ag-Ab* Omogenei: nessuna separazione tra Ab* e Ag-Ab*

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI (SANDWICH)
Aggiunta del campione Antigene Enzima Aggiunta del tracciante Tracciante Anticorpo di rivelazione Incubazione Substrato enzimatico Anticorpo di cattura immobilizzato Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida

Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

DIRETTI INDIRETTI

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Anticorpo Enzima Aggiunta del tracciante Tracciante Anticorpo specie-specifico Incubazione Substrato enzimatico Lavaggio Antigene di cattura immobilizzato Aggiunta del substrato Misura del segnale Fase solida

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI
METODO PER LA DETERMINAZIONE DI ANTICORPI Aggiunta del campione Aggiunta del tracciante Incubazione Lavaggio Aggiunta del substrato Misura del segnale

METODI NON COMPETITIVI OMOGENEI
substrato prodotto intermedio prodotto finale Due anticorpi monoclonali diretti contro diversi epitopi dell’antigene vengono marcati con due enzimi scelti in modo che il prodotto della reazione catalizzata dal primo sia il substrato per il secondo (es. glucosio ossidasi e perossidasi). Solo quando i due anticorpi sono legati all’antigene gli enzimi sono sufficientemente vicini per ottenere quantità misurabili del prodotto finale. In alternativa si possono marcare i due anticorpi con due subunità dello stesso enzima, con un donatore ed un accettore di una coppia FRET (fluorescence resonance energy trasfer), ecc...

METODI NON COMPETITIVI OMOGENEI
SISTEMA INDICATORI i1/i2 SUBSTRATI PRODOTTI P1/ P1 Enzimi vicinali Esochinasi/ GPDasi ATP/glucosio NAD+ Glucosio 6-fpsfato Gluconolattone-6-fosfato + NADH GOasi/ POasi Glucosio/ Donatore H ossidato Perossido/

METODI OMOGENEI NON COMPETITIVI
Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP) Analita di grandi dimensioni: metodo non competitivo con tracciante=anticorpo marcato (meno utilizzato) anticorpo analita marcato (in eccesso) bassa %P alta %P %P [analita]

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
La concentrazione dell’analita nel campione viene determinata per interpolazione su una curva-dose risposta prodotta in parallelo utilizzando degli standard. La curva viene prodotta rappresentando il segnale ottenuto per ciascun standard in funzione della concentrazione di analita nello standard. La curva ideale è lineare. In realtà la curva dose-risposta può presentare una curvatura a dosi basse di analita a causa di un legame aspecifico ed una curvatura a dosi alte a causa della saturazione dell’anticorpo di cattura o di rivelazione. Segnale Concentrazione analita aspecifico saturazione

PARAMETRI QUANTITATIVI
Limite di rivelazione Calcolato in funzione della deviazione standard del bianco Segnale Sensibilità pendenza della curva concentrazione analita Intervallo dinamico

EFFETTO DEI PARAMETRI SPERIMENTALI
B/B0 concentrazione analita Riduzione del limite di rivelazione: Aumentare la costante di affinità dell’anticorpo Migliorare la rivelabilità assoluta del tracciante (in questo caso il limite di rivelazione dipende direttamente da essa)

METODI COMPETITIVI E NON COMPETITIVI (MA E AA)
CARATTERISTICHE Più rapidi, particolarmente a basse concentrazioni di analita. L’utilizzo di anticorpi monoclonali migliora la specificità Specificità intrinseca superiore Limite di rivelazione più basso Amplificazione di attività (AA) (Metodi non competitivi) Modulazione di attività (MA) (Metodi competitivi)

INTERFERENZE NEI METODI IMMUNOMETRICI
I metodi immunometrici sono soggetti ad interferenze, soprattutto per quanto riguarda la reazione immunologica e la rivelazione del segnale. Le cause più comuni sono: la presenza nel campione di molecole che danno reazione crociata con l’anticorpo o che interferiscono con la formazione del complesso antigene-anticorpo o che competono con l’anticorpo per il legame con l’antigene (es proteine del siero), ecc; la presenza nel campione di enzima endogeno (nel caso di EIA), di molecole colorate o fluorescenti (nel caso di rivelazione spettrofotometrica o fluorescente), ecc. Questo fenomeno può essere notevolmente ridotto adottando un metodo eterogeneo, grazie ai lavaggi effettuati prima della misura.

VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI
Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Elevata specificità di riconoscimento tra Ag e Ab Campioni fluidi (siero, urina, latte) Campioni solidi (carne, matrici vegetali, tessuti)

Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Impiego di traccianti, cioè reattivi biospecifici con elevato rapporto segnale/massa Traccianti: Ag o Ab coniugati chimicamente con un marcatore (“label”)  Piccoli volumi di campione  Piccoli volumi di reagenti (riduzione dei costi)  Diagnosi precoce  Determinazione di sostanze in tracce

Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Impiego di piastre microtiter a 96 o 384 pozzetti Analisi di numerosi campioni (ca. 40 o 200 in duplicato) nella stessa seduta analitica Rapidità di esecuzione (poche ore) Analisi di numerosi campioni per giorno

Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Disponibilità di dispensatori, lavatori, lettori ed elaboratori del segnale automatici Ottimizzazione delle fasi analitiche errori precisione e accuratezza tempi di esecuzione rapidità

POSSIBILI FORMATI ANALITICI
Piastre microtiter In commercio sono disponibili numerosi kit su piastra microtiter a 96 pozzetti, spesso con traccianti enzimatici e rivelazione colorimetrica. Il kit contiene la piastra con l’anticorpo immobilizzato e tutti i reagenti pronti all’uso. E’ necessario disporre di pipette per la dispensazione e di alcune attrezzature (lettore di micropiastre per la misura del segnale ed eventualmente dispensatori, lavatori, ...) Analizzatori automatici

Metodi immunologici per ioni metallici
Metodo Immunoenzimatico Competitivo per l’analisi del Cadmio (II) nell’acqua Si utilizza un anticorpo monoclonale che riconosce il complesso Cd-EDTA Fase pre-analitica: 1 -diluire il campione d’acqua 1/10-1/100 v/v con tampone 2 –si aggiunge un eccesso di EDTA Dosaggio immunoenzimatico

Metodo Immunoenzimatico Competitivo per l’analisi del Cadmio (II) nell’acqua Tracciante: Cd(II)-EDTA-HRP Campione Microtiter pozzetti Anticorpo immobilizzato Incubazione: 60 min. at 37°C Curva di calibrazione Lavaggio Signale CL Rivelazione Chemiluminescente del tracciante HRP: H2O2/luminolo/enhancer [Cd(II)], μg/L

Ү Ү Ү Ү Ү Ү Metodi immunologici per ioni metallici
Determinazione di Hg(II) mediante metodo immunologico non competitivo: EPA metodo ufficiale HRP Ү Ү HRP Ү Ү Ү Ү GSH GS-Hg GSH GS-Hg GSH GS-Hg GSH Add HRP-Ab anticorpo GS-Hg anticorpo HRP substrato campione Segnale Campioni liquidi : Analisi diretta (solo diluizione) Campioni solidi : Estrazione di Hg(II) con HCl/HNO3 poi si tampona a pH=7 The extract is added to the microtiter wells where the BSA-GSH is immobilized: the Hg ions bind the glutathione This complex is detected using an antibody anti-BSA-glutatione-Hg and with a secondary HRP labeled antibody

Determinazione di Hg(II) mediante metodo immunologico non competitivo: EPA metodo ufficiale Caratteristiche analitiche Limite di rivelazione: 0.4 μg/l Specificità: altamente specifico per Hg(II): Quantità richiesta per dare un ‘interferenza (ppm) Mercurio Piombo >150,000 Arsenico >55, Nichel >43,000 Bario >100, Argento > 79,000 Cadmio >82, Sodio >17,000; Cromo > 38, Stronzio >64,000 Rame > 47, Tallio >150,000 Oro > 144, Zinco >48,000 Ferro >41,000 :

METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO
DTERMINAZIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO + + Ab anti-ferritina marcato con HRP Ab monoclonali ani-ferritina Ferritina presente nel campion/stadards/controllo 60 min 37 °C + 30 min 25 °C Lettura del segnale a 492 nm Colorazione giallo-arancione

Limite di misura = la più piccola concentrazione in ferritina
METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO DTERMINAIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO CARATTERISTICHE DEL METODO Limite di misura = la più piccola concentrazione in ferritina significativamente differente dal valore dello standard O con una probabilità del 95% = 2 ng/ml Specificità: ferritina di milza umana 100% di reazione crociata ferritina di fegato umano 112% di reazione crociata ferritina di cuore umano 62% di reazione crociata

Production Of Monoclonal Antibodies
Immunisation with antigen Cell line –myeloma P3– NSI/I – Ag4 – 1 X63 – Ag Spleen suspension Ab1 Ab2 Abn Ab titre from serum Fusion with P.E.G. Selection with H.A.T. Screen for Ab – secreting hybrids Clone Ab secreting hybrids Clone Clone Clone n In vivo Ab1 Serum/ascitic fluid containing Abn Ab2 Abn

Production of Stable Antibody Secreting Hybrid
1st Cloning Hybrid Ab Hybrid Abn Hybrid Non Secretor Cell division Hybrid Non-Secretor Hybrid Ab1 2nd Cloning Stable antibody secreting hybrid

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