COLORAZIONE DEI M.O. I preparati colorati consentono di aumentare il contrasto tra cellula e ambiente facilitando l’osservazione della morfologia batterica.

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1 COLORAZIONE DEI M.O. I preparati colorati consentono di aumentare il contrasto tra cellula e ambiente facilitando l’osservazione della morfologia batterica e permettendo allo stesso tempo l’individuazione sia di strutture particolari ,quali Capsule Flagelli Spore sia di affinità tintoriali specifiche di gruppi batterici come il comportamento alla colorazione Gram. Le tecniche di colorazione comportano l’uccisione mediante calore ( Fissazione) dei M.O. Ciò rende sicura la colorazione anche di specie patogene.

2 Natura dei coloranti CROMOFORO AUXOCROMO
Sono composti organici costituiti da un gruppo CROMOFORO e un gruppo AUXOCROMO CROMOFORO AUXOCROMO I gruppi cromofori sono caratterizzati da doppi legami insaturi capaci di assorbire alcune radiazioni elettromagnetiche e di apparire conseguentemente del colore delle radiazioni emesse I gruppi auxocromo invece sono gruppi atomici ,di solito di carattere acido o basico in grado di legarsi al substrato. La contemporanea presenza dei due gruppi conferisce a una molecola di essere colorata e agire da colorante

3 Tipi di coloranti Coloranti basici Coloranti acidi
Nelle colorazione dei batteri si utilizzano soprattutto coloranti all’Anilina ( compo sto organico che sintetizzerai in quinta) distinguibili in acidi o basi a seconda del Comportamento del radicale auxocromico . Poiché il Citoplasma batterico è ricco di acidi nucleici l’affinità è maggiore per quelli basici. Coloranti basici Coloranti acidi Blu di metilene , violetto di Genziana,Cristal violetto Safranina ,Fucsina basica,Verde metile Eosina , Fucsina Acida nigrosina Si preparano sciogliendo la sostanza colorante in polvere nel rispettivo solvente in genere Alcol. Sono dette perciò soluzioni idroalcoliche madri perché permettono la conservazione a lungo.

4 Il comportamento dei batteri alle colorazioni
Il comportamento può essere spiegato attraverso la combinazione di ipotesi Su fenomeni chimici,in particolare il Legame tra colorante e Substrato cellulare E sui meccanismi di PERMEABILITA’ che dipendono soprattutto dalla composi zione della Parete. essendo i M.O. impermeabili alla maggior parte dei coloranti occorre uccidere i batteri con il calore per consentire la Denaturazione della membrana e la penetrazione del colorante. per favorire l’ulteriore azione del colorante si utilizzano delle sostanze dette MORDENZANTI queste hanno affinità sia per il substrato sia per il colorante e quindi legano il primo al secondo. possono essere mescolati già al colorante oppure aggiunti separatamente. I più usati sono il REATTIVO DI LUGOL e l’Acido FENICO.

5 Colorazione di GRAM Prerequisiti :
È una colorazione differenziale fondamentale in batteriologia in quanto oltre a permettere l’osservazione della forma rappresenta un elemento di base nella classificazione batterica. Si distinguono infatti in Gram + e Gram -. Si impiega come colorante primario il CRISTAL VIOLETTO e un Mordenzante Il LUGOL ( soluzione IODO-IODURATA) in modo da legarsi ai componenti cellulari Acidi e colorare tutte le cellule di viola. Il trattamento successivo con Alcol ( o alcol-acetone) decolora i batteri Gram – mentre i Gram + resistono rimanendo viola.

6 Differenze sulla struttura della Parete Cellulare
GRAM - GRAM + A causa della solubilità in alcol dei lipidi delle pareti , la Permeabilità aumenta il complesso CRISTAL VIOLETTO viene estratto L’alcol disidrata le pareti ,la permeabilità si riduce il complesso CRISTAL VIOLETTO non può venire estratto Il colorante di contrasto la SAFRANINA che si aggiunge dopo si lega ai componenti acidi Rimasti liberi dei GRAM – e li colora in Rosso

7 Comportamento dei GRAM+ e dei GRAM -ai passaggi della colorazione
CRISTAL VIOLETTO Mordenzante Lugol Alcol Safranina

8 Tecnica per la colorazione GRAM
Allestire e fissare i preparati utilizzando colture di Gram- e di Gram+ Poggiare i vetrini su di una vaschetta Ricoprire il vetrino con il Cristal Violetto per 1 minuto Versare l’eccesso di colorante e lavare con poca H2O Ricoprire con il mordenzante Lugol e lasciare agire per 1 minuto Far scivolare l’eccesso di Lugol lavare con acqua Decolorare per un tempo variabile secondi finche il preparato non lascia più colore. Lavare con acqua Contrastare con Safranina per 1 minuto Sciacquare con acqua sgocciolare il vetrino e lasciarlo asciugare all’aria Osservare al microscopio Gram+ Viola-blu Gram - rossi