Genoma Umano e malattie genetiche lezione 3-4 Martedì 5 Maggio

Presentazione sul tema: "Genoma Umano e malattie genetiche lezione 3-4 Martedì 5 Maggio"— Transcript della presentazione:

1 Genoma Umano e malattie genetiche lezione 3-4 Martedì 5 Maggio

2 le regioni regolative non ci sono molti esempi già studiati
il primo classico è quella del locus della  globina una Locus Control Region fa parte di un cluster genetico a livelli superiori mancano degli esempi più chiari potrebbero mancare oppure sono da scoprire

3 regioni regolative con funzione bidirezionale
per ora gli esempi più chiari stanno nelle Regioni Regolative costituite da Enhancers questo livello è molto vicino alla attività trascrizionale dei geni che controllano e che costituiscono il cluster genico questo tipo di controllo può essere bidirezionale: TOP - DOWN BOTTOM - UP

4 esempio del cluster delle Ig
la risposta immunitaria è data dall’interazione di molte cellule e di molte funzioni collegate con la regolazione dell’espressione delle Ig sono collegate molte altre funzioni che sono coregolate o coordinate il coordinamento deve prevedere: - interazioni intracellulari “ extracellulari intracellulari: sopravvivenza, selezione, controllo moltiplicativo extracellulari: interazioni con le altre cellule della risposta immune “cross talking” tramite interleukine

5 partiamo da un esempio un sistema piuttosto noto ed interessante
la regolazione delle immunoglobuline e dei linfociti B la maturazione e l’attivazione vanno di pari passo sistema multifattoriale esempio di interazione genoma ambiente

6 the study of the 3’RR TOR VERGATA different aspects of the study of a regulatory region interactions of a regulatory region: unidirectional flux ? the jerarchy of the regulation the genome is controlled by epigenetic events interactions of genome and environment these events open the possibility of a non univocal flux needs to be bidirectional

7 interactions and jerarchy
TOR VERGATA interactions and jerarchy epigenetic modifications of the region: nucleosome remodeling; methylation

8 tools for a RR study TOR VERGATA the tools : - evolutionary conservation and transformations - polymorphisms in humans (any kind!) - transgenic models in mouse - in vitro assays with cell lines (mouse and human)

9 “La regione regolativa 3’ della catena pesante delle Ig: struttura e funzioni”
La tragedia dei linfociti B nati per morire all’ 80% Il 20 % che sopravvive svolge il suo ruolo solo nella vecchiaia (a parte le memory cells che sono minoranza) - processi di maturazione ed interazioni cluster delle IgH (heavy) e struttura della regione regolativa processo evolutivo instabilità e regioni duplicate nell’uomo la regione IgH3’RR duplicata l’enhancer HS1,2-A/B è duplicato e polimorfico studio dell’attività tramite geni reporter in cellule trasfettate studio dei fattori che legano la sequenza enhancer EMSA

10 cascata di fosfatasi e kinasi
nel processo di maturazione dei linfociti B si verifica una cascata di segnali CD45 Rap 1 MAPKs prima degli eventi di riarrangiamento messo in moto dal preBCR

11 riarrangiato. IgM prodotto in membrana. Lo splicing produce anche IgD
ANTIGENE INDIPENDENTE ANTIGENE DIPENDENTE Locus Catene leggere V-J processing VJ riarrangiato VJ riarrangiato VDJ riarrangiato. IgM prodotto in membrana. Lo splicing produce anche IgD VDJ riarrangiato. IgM prodotto in membrana Locus Catene pesanti D-J processing V-DJ processing VDJ riarrangiato VDJ riarrangiato CELLULE B maturazione Fig. 5A Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B.

12 maturazione II Locus Catene leggere Locus Catene pesanti CELLULE B
ANTIGENE DIPENDENTE DIFFERENZAZIONE FINALE VJ riarrangiato VJ riarrangiato Ipermutazioni somatiche Plasmacellule Cellule Memoria Cellule B attivate Centrociti VDJ riarrangiato. Le catene m prodotte in forma di membrana Switch isotipico a Cg, Ca o Ce. Ipermutazione somatica Switch isotipico. Ipermutazione somatica. Catene pesanti prodotte in forma di membrana Switch isotipico. Catene pesanti prodotte in forma secreta. VDJ riarrangiato Catene m prodotte in forma secreta. maturazione II Fig. 5B Schema del riarrangiamento delle catene leggere e pesanti dell’immunoglobuline in correlazione con la maturazione dei linfociti B.

13 induzione dello switch
PLASMACELLULE Cellule B proliferanti Cellula B attivata (centroblasto) IL-2; IL-4; IL-5; IgG2a o IgG3 IgA o IgG2b IgE o IgG1 IgM IFN-g IL-4 TNF-b Citokine proliferanti: IL-2; IL-4; IL-5; Citokine per il differenzamento: IL-2; IL-4; IL-5; IFN-g; TNF-b; Fig. Azione delle citochine sulla ricombinazione class switching (CSR) cellule denditriche e T-helper

14 ricombinazione Switch region: IgM Ricombinazione class switching (CSR)
VH DH JH CH Ricombinazione V(D)J Switch region: V(D)J m d g3 g1 2b 2a e a Consiste di sequenze ripetute tra 1 e 10 kb IgM Ricombinazione class switching (CSR) Il filamento non stampo è ricco in G 2a V(D)J m e a Sm, Sa ed Se hanno un repeat di 5 bp. Sg ha un repeat di 49 bp. d 2b IgE g3 g1 Risultato dello switch Circolo exciso Fig. Ricombinazione class switching (CSR) nel topo.

15 mappe dei loci IgH e IgL LOCI DELLE CATENE PESANTI E LEGGERE DELL’Ig
Locus catena leggera l Locus catena leggera k Locus catena pesante Cromosoma 22 Cromosoma 2 Cromosoma 14 LOCI DELLE CATENE PESANTI E LEGGERE DELL’Ig

16 Riparazione dei breaks
il riarrangiamento A B C D F E Trascrizione regione S RNA editing ? AID? CSR ricombinasi? Riconoscimento delle regioni S accessibili Formazione di breaks al DNA Modifica l’RNA e/o le strutture del DNA delle regioni S accessibili Formazione di strutture secondarie (R loop?) Attivazione dei sistemi di riparazione del DNA Riparazione dei breaks S c-myc una regione S due regioni S Switch su un altro cromosoma traslocazione Class switching recombination Delezioni intra-switch 2 1 Modelli che spiegano la Ricombinazione class switching (CSR). Activation-induced cytidine deaminase (AID)

17 espressione nelle  fasi di sviluppo
Sviluppo dei linfociti B indipendente dall’ antigene pro-B “committed” esprimono B220 (CD45) e anche CD 43, TdT terminal deossitransferasi, RAG-1, RAG-2, CD19 pre-B diminuzione di CD43, RAG-1 e 2, scomparsa di TdT, riarrangiamento della catena pesante, pBCR pre B cell receptor, riarrangiamento produttivo della catena leggera espressione di membrana di IgM Trascrizione dei surrogati delle catene leggere  Ig / formano il pre-B cell receptor complex di membrana essenziale per le fasi di sviluppo (CD45 - B220 - fosfotirosin fosfatasi PTPase integra i segnali durante lo sviluppo, non necessario per la linfopoiesi, forse è un’attività ridondante) CD19 interagisce con le tirosin-kinasi, non è essenziale, però favorisce l’entrata nel circolo periferico

18 maturazione nel germinal center
avviene in associazione intima con cellule THelper e cellule dendritiche del follicolo : -proliferazione clonale -ipermutazioni somatiche -selezione di affinità (self ed altro) -selezione negativa -switch isotipico

19 strutture regolative della trascrizione e indirettamente del riarrangiamento delle IgH
promotori dei geni V enhancer intronico iE ECS (evoluz. conserved seq.) intervening 5’ CH genes 3’ Ig heavy 3’ enhancer complex o regulat. region k intronico iE 3’E  light chain E si attivano per la trascrizione sterile insieme a RAG1/2 con altri enzimi del riparo, variazione di metilazione e di struttura cromatinica, gli enhancers necessari anche per la ricombinazione V(D)J I riarrangiamenti sono regolati da fattori di trascrizione ubiquitari e tessuto specifico

20 evoluzione delle Ig Cluster organization: Translocon organization:
Sharks (hom shark)- multiple loci of each type except IgMgj Channel catfish ( kb) lungfish coelacanths Xenopus (~800 kb) Duch and chicken Cattle Rabbit Mouse Human IgM IgNAR IgW IgM1gj IgY IgX E (V DDJ Cm)200 (V DDDJ NAR)>2 (V DD J C)<10 (VD J Cm1gj)<10 (multiple chromosomes) (not L chain-associated) many V’s VDJ D,J’s Cm V’s D’s 9J’s Cm Cdsec Cdmem several V’s Presumptive arrangement D, J’s C VD’s(>100) J’s V’s( ) D(>15) J(8-9) Sm C  S C  S pseudoV’s(~100) V D’s J C a Sa V’s(~15) D(>3) J(2) Sm Cm Sg3 Cg3 Sg1 Cg1 Sg2 Cg2 Se Ce Sa Ca Sd Cd V’s(~100) D(14) J(6) Sa Ca Sg Cg J(4) S Cg3 S Cg1 Cd S Cg2b S Cg2a S Ce S Ca D(27) S  S Ca1 S Ca2 S Cg2 S Cg4 350 kb 200 kb 13 Ca genes 150 kb (cattle) 48 kb (duck); 80kb (chicken) Transcriptional orientation ? 7 geni costanti forse 13 geni costanti 8 geni costanti 10 geni costanti dipnoi crossopterigi (latimera) teleostei evoluzione delle Ig

21 cluster Ig topo-uomo centromero telomero trascrizione
Mouse Igh cluster Chromosome 12 Human Igh cluster Chromosome 14 12F1 14q32.33 mta1 JDV crip2 crip1 hole a e g2a g2b g1 g3 d m Em J D V a2 g2 a1 e g4 g elk 2.1 hs4 hs1.2 hs3 20bp 3’a1 elk 2.2 3’a2 hs 4 hs 3B hs 1,2 hs 3A hs 3 BAC199M11(AF450245) 86,035,000 86,040,000 86,045,000 86,050,000 86,055,000 86,065,000 86,070,000 86,075,000 86,060,000 85,894,500 85,904,500 85,914,500 85,924,500 85,934,500 85,944,500 85,954,500 trascrizione (rischio riarrangiamenti) IgH3’RR-A IgH3’RR-B