Lezione 1-2 lunedì 28 Marzo 2011 aula 6A ore 14.00-16.00 corso “vettori biologici” Modulo 2.

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1 Lezione 1-2 lunedì 28 Marzo 2011 aula 6A ore 14.00-16.00 corso “vettori biologici” Modulo 2

2 libro di testo un libro di testo con parte degli argomenti del corso è: Biotecnologie molecolari Principi e tecniche di Terry A.Brown Zanichelli editore Altro materiale sarà presentato con articoli scientifici

3 argomenti del programma ripassare e sapere il programma di biologia molecolare e microbiologia a livello necessario per sapere: - cosa è un gene e da cosa è costituito e organizzato (regione genomica, trascritta e tradotta) - enzimi di restrizione - analisi Southern - analisi Northern (chi dice che un Northern si fa usando enzimi di restrizione non può passare l’esame) - cosa vuol dire clonaggio e clonare e a che serve - cosa vuol dire isogenico, singenico, colineare - differenza tra clonare cellule (batteriche o eucariotiche) e in gergo clonare un frammento di DNA - plasmidi batterici da cui i così detti vettori

4 Argomenti del corso Molte delle informazioni oltre che sul libro si trovano con google e anche su wikipedia in forma molto concisa e un po’ superficiale, ma va saputa per bene almeno la tecnica per dedurre a cosa serve ed il campo di applicazione Le tecniche che cerchiamo di descrivere si basano su conoscenze di biologia molecolare, genetica dei microorganismi e genetica degli eucarioti. Il valore della tecnica sta nelle possibilità sperimentali che apre sia applicative che di studio di conoscenze di base

5 esemplificazioni Cercheremo di fare esempi e non elenchi Da alcuni elenchi si possono prendere degli spunti importanti Sono come gli aforismi e dei punti di partenza per riflettere Vorremmo vedere come si possono costruire dei vettori a partire dal materiale disponibile e delle conoscenze disponibili per affrontare delle domande ed ottenere delle risposte Quindi ci sono degli obbiettivi, si vorrebbe risolvere un problema e si pensa al vettore come il mezzo

6 come definiamo un vettore vettore nel nostro caso è un trasportatore di materiale genetico di interesse verrà costruito e manipolato secondo i criteri e le strategie necessarie per farlo funzionare allo scopo di nostra utilità e quindi con le varie finalità scelte Il vettore conterrà il materiale genetico necessario per far svolgere le funzioni secondo i criteri stabiliti

7 argomenti del corso : diversi metodi di clonaggio utilizzati con i nuovi tipi di plasmide vettori adattati per i diversi scopi, origine procariotica ed eucariotica (plasmidi/virus più altre componenti funzionali) Sono adatti per scopi ed utilità contingenti che cambiano per frammenti genomici e sottoclonaggi per geni o cDNA da far esprimere per geni di fusione e geni reporter per cotrasfettare con altri plasmidi per indurre l’espressione per espressione in eucarioti ed in animali transgenici per ricombinazione (estremità virali LTR) per vettori con metodo FLP-TRex per excisione e ricombinazione Cre-Lox per RNA interference

8 tecniche applicative Dai metodi di preparazione, estrazione, manipolazione, controlli, trasfezione, dai procarioti agli eucarioti clonaggio analisi dei fenotipi e dell’espressione

9 cambiamenti con l’avvento della PCR l’invenzione della PCR ha cambiato, stravolto e aggiunto molte tecniche di biologia molecolare dalla amplificazione del DNA a tutte le nuove applicazioni che semplificano i metodi di clonaggio e di preparazione dei vettori utilizzati per biotecnologia molte variazioni alla semplice tecnica della PCR con ricadute imprevedibili prima dell’invenzione di questa tecnica

10 PCR per tutti gli usi con la PCR e molte cose sono cambiate. tecnica di base classica: il metodo vari tipi di applicazioni: controlli su sequenze note nested inversa RT-PCR RACE 3’ RACE 5’ uso di linkers AFLPs, analisi SNPs e altri polimorfismi mutagenesi Nucleotidi singoli mutagenesi per frammenti più grandi costruzione di DNA sintetici (recursive PCR)

11 sequenziamento del DNA aggiornato microarrays (resequencing anche per polimorfismi) metodo pirosequenziamento la corsa verso “whole genome” diventa una routine genomica ? dal piccolo al grande e dal grande al piccolo (dai cromosomi alla sequenza e viceversa) il cerchio si chiude ? la conoscenza dei genomi cosa ha cambiato e sta cambiando ? Si usano dei vettori? I Bac servono ancora?

12 RNA interference small RNAs le basi molecolari del fenomeno le possibili applicazioni, come si può utilizzare, in quali casi le metodologie sviluppate per quali domande della Biologia sono applicabili I piccoli siRNA come si manipolano? Come si isolano, come si clonano in quali vettori

13 animali transgenici tecniche semplici e su organismi diversi e vegetali sul topo: per ricombinazione omologa per knock out (e knock in?) vettori specifici metodo Cre-Lox induzione tessuto specifica mutanti condizionali La domanda spinge a cercare nuove soluzioni in nuovi vettori

14 cominciamo con i vettori di clonaggio una delle rivoluzioni in biologia fu la constatazione che qualunque DNA una volta purificato si manipolava nello stesso modo a prescindere dalla sua origine di specie la stessa cosa vale per le proteine il materiale biologico è universale così come i minerali che anche su Marte e sulla Luna sono identici

15 Quale è il suo materiale genetico L’hanno trovato in un meteorite, potrebbe essere vero o artefatto, potrebbe essere un bruscolo inorganico, ma se fosse biologico potrebbe estendere all’universo l’origine della vita e non cambierebbe un granchè, la terra non sarebbe più unica

16 il plasmide è circolare però non è rigido assume forme diverse non casuali si avvolge si superavvolge la forma rilassata o si rilassa è una molecola di DNA circolare procariotica manipolata e con diversi enzimi unita ad altre strutture di DNA per consentirgli nuove funzioni utili. Queste molecole assemblate artificialmente sono stati chiamati vettori

17 come si vede al Microscopio Elettronico come si estrae? come si purifica? è più resistente del DNA lineare come si può analizzare ? su gel di agarosio corre in modo diverso come se avesse pesi diversi rilass. avvolto super avv. Sempre meno al microscopio

18 la loro importanza dovuta al clonaggio il primo che capì l’uso dei plasmidi per il clonaggio si pose giustamente dei problemi etici possiamo trasferire l’informazione genetica dove si vuole ? la prima volta fece impressione si trattava di organismi procarioti l’idea di pericolo e la paura successiva derivano dalla possibilità di trasformare una informazione genetica che diventa definitiva e non più solo somatica

19 i cloni e clonare sono colonie di cellule derivate da una unica cellula progenitrice tutte le cellule di un clone sono isogeniche (salvo mutazioni intercorse) assolutamente vero per tutti gli organismi (esclusi i mosaici) anche gli eucarioti sono un clone a partire dallo zigote il differenziamento causa la diversità fenotipica ma il genoma è identico  il clone organismo eucariotico

20 cosa sottointende clonare l’assunto è far partire una crescita da una singola cellula bisogna esser capaci a fare isolamenti di singole cellule in microbiologia e bio cellulare si parte da diluizioni estreme in genetica molecolare clonare ha preso il significato di isolare un frammento di DNA inserendolo in un vettore per manipolarlo e riottenerlo insieme al vettore che si moltiplica all’interno dell’organismo o delle cellule in cui è stato inserito, secondo le diverse funzioni del vettore cosa ci vuole per clonare ?