METODI IMMUNOMETRICI I metodi immunometrici, sfruttando le caratteristiche uniche di selettività e di avidità del legame antigene-anticorpo, permettono.

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1 METODI IMMUNOMETRICI I metodi immunometrici, sfruttando le caratteristiche uniche di selettività e di avidità del legame antigene-anticorpo, permettono lo sviluppo di metodi altamente specifici per la quantificazione dell’analita, anche in matrici complesse. campione + complesso antigene-anticorpo anticorpo quantificazione del complesso antigene-anticorpo

2 Anticorpi monoclonali Anticorpi policlonali
epitopo paratopo CDR antigene ponte disolfuro intracatena ponte disolfuro intercatena frammento Fab frammento Fc Catena H Catena L IgG - anticorpi che tendono a durare molto a lungo, anche tutta la vita; IgM - durano poco tempo, e indicano un contatto recente con l'antigene; IgA - non si misurano nel sangue, ma sono presenti sulla superficie di alcuni organi, come per esempio gli alveoli polmonari; IgD - presenti sulla superficie dei linfociti B maturi; IgE - immunoglobuline che intervengono nei processi che regolano le reazioni allergiche (ipersensibilità nei confronti di vari antigeni, alimentari, ambientali, ecc.). Anticorpi monoclonali Anticorpi policlonali

3 METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI REAZIONI DI IMMUNOPRECIPITAZIONE
In opportune condizioni la formazione del complesso antigene-anticorpo dà luogo ad una reazione di precipitazione. -(A) Eccesso di anticorpo (Ab) -(B) Zona di equivalenza (zona più interessante a fini analitici). -(C) Eccesso di Ag Ab precipitato A B C Ag

4 METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI REAZIONI DI IMMUNOPRECIPITAZIONE
La “composizione” del precipitato varia fortemente nelle tre zone. La precipitazione degli aggregati antigene-anticorpo (reazione di immunoprecipitazione) rappresenta una tecnica molto utilizzata per l’analisi qualitativa e quantitativa di componenti relativamente abbondanti nel siero, in particolare delle proteine sieriche. Nell’ambito delle tecniche basate su reazioni di immunoprecipitazione abbiamo: -Tecniche basate sulla diffusione -Tecniche di immunoprecipitazione in fase liquida -Tecniche di tipo elettroforetico In senso lato, anche le tecniche immunometriche propriamente dette (es. tecniche immunoenzimatiche) si possono considerare tecniche di immunoprecipitazione. Ab precipitato A B C Ag

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6 METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI REAZIONI DI IMMUNOPRECIPITAZIONE
Diffusione monodimensionale semplice: la soluzione contenente (potenzialmente) l’antigene in esame viene stratificata sopra un gel di agar contenente un opportuno antisiero. Diffusione monodimensionale doppia: fra le due soluzioni viene interposto un ulteriore stato di gel di agar (“zona neutra”). Le bande si formano quindi dove la diffusione di entrambe le specie porta al raggiungimento dei rapporti ottimali di concentrazione antigene/anticorpo. Soluzione contenente l’antigene Diffusione Gel di agar contenente l’antisiero Zona neutra Diffusione

7 METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI REAZIONI DI IMMUNOPRECIPITAZIONE
Soluzione contenente l’anticorpo Soluzioni contenente l’antigene Nelle tecniche di diffusione bidimensionale si utilizza uno strato di gel di agar, nel quale sono stati ricavati pozzetti nei quali vengono poste le soluzioni in esame e la soluzione di anticorpo. A seguito della diffusione radiale dei vari componenti, ove possibile si formano “archi” di precipitato che identificano l’avvenimento della reazione antigene-anticorpo. Con opportune modificazioni questa tecnica è applicabile anche a fini quantitativi (es. tecniche di immunodiffusione radiale: usando solo l’antigene nei pozzetti, mentre l’anticorpo è disciolto nel gel di agar, l’area delle bande che si formano è proporzionale alla concentrazione dell’antigene). Reazione antigene-anticorpo Nessuna reazione Diffusione

8 IMMUNODIFFUSIONE RADIALE SEMPLICE: ESEMPIO

9 IMMUNODIFFUSIONE RADIALE DOPPIA: ESEMPIO

10 METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI
REAZIONI DI IMMUNOPRECIPITAZIONE Immunoelettroforesi: - elettroforesi - deposito di antisiero REAZIONI DI AGGLUTINAZIONE Elementi corpuscolari (globuli rossi, batteri,…): - provetta - vetrino

11 REAZIONE DI AGGLUTINAZIONE: ESEMPIO
TEST DI GRACIDANZA

12 REAZIONE DI AGGLUTINAZIONE

13 METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI
Tecniche di immunoprecipitazione in fase liquida Nelle tecniche di immunoprecipitazione in fase liquida il precipitato formatosi a seguito della reazione antigene-anticorpo viene di solito quantificato attraverso l’effetto Tyndall, La quantificazione del precipitato può avvenire mediante turbidimetria o nefelometria (la seconda è nettamente più sensibile, permettendo di raggiungere limiti di rivelazione nettamente minori di quelli ottenibili con le tecniche di diffusione). Misura della luce “assorbita”: turbidimetria Luce incidente Misura della luce diffusa: nefelometria

14 Utilizzo di traccianti per rivelare la formazione
IMMUNODOSAGGI Utilizzo di traccianti per rivelare la formazione del complesso antigene-anticorpo Metodi competitivi Metodi non competitivi

15 METODO COMPETITIVO per la detrminazione di Ag
1 2 3 a) aggiunta reattivi tracciante analita b) reazione Conc. analita Tracciante legato 4 16 2 3 1 c) Aggiunta substrato Siti anticorpali in difetto Concentrazione costante di tracciante

16 Analita immobilizzato
METODO COMPETITIVO per la detrminazione di Ab E Aggiunta antigene e anticorpo Aggiunta dell’anticorpo marcato Substrato Segnale Competizione per il sito anticorpale Separazione Misura dell’attività enzimatica Anticorpoanti-IgG marcato Analita immobilizzato Anticorpo anti-analita Analita libero E

17 Concentrazione analita
METODI NON COMPETITIVI per la detrminazione di Ag Siti anticorpali in eccesso DIRETTI INDIRETTI Segnale Concentrazione analita saturazione aspecifico In realtà la curva dose-risposta può presentare una curvatura a dosi basse di analita a causa di un legame aspecifico ed una curvatura a dosi alte a causa della saturazione dell’anticorpo di cattura o di rivelazione.

18 Concentrazione analita
METODI NON COMPETITIVI per la detrminazione di Ab Segnale Concentrazione analita

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20 ESEMPI DI TEST COMPETITIVI E NON COMPETITIVI
Tecnica Range Tempi analisi FT4 Competizione 0-7 ng/ml 90’ T3 0-6 ng/ml 60’ T4 0.25µg/dl Ig-E Sandwich 0-500 IU/mL 180’ Prolattina 0-400 ng/ml FSH 0-150 mIU/ml 150’ Cortisolo 0-50 µg/dl

21 METODI COMPETITIVI E NON COMPETITIVI (MA E AA)
CARATTERISTICHE Più rapidi, particolarmente a basse concentrazioni di analita. L’utilizzo di anticorpi monoclonali migliora la specificità Specificità intrinseca superiore Limite di rivelazione più basso Amplificazione di attività (AA) (Metodi non competitivi) Modulazione di attività (MA) (Metodi competitivi)

22 METODI ANALITICI BASATI SU ANTICORPI
TRACCIANTI Nei metodi basati su reazioni di immunoprecipitazione la formazione del complesso antigene-anticorpo viene evidenziata attraverso la diffusione della luce determinata dal precipitato. Per analiti presenti in concentrazioni molto basse e/o per i quali il complesso antigene-anticorpo non precipita (es. molecole di piccole dimensioni) i metodi di immunoprecipitazione non sono applicabili o sono troppo poco sensibili. Purtroppo la reazione è difficilmente rivelabile sfruttando le diverse proprietà fisiche del complesso An-Ab rispetto ad An libero. Sebbene metodi immunometrici “label-free” siano in linea di principio utilizzabili (es. misurando le differenze di massa misurabili con biosensori piezoelettrici o le diverse proprietà ottiche con un sistema basato sulla SPR come il sistema Biacore) è’ più pratico utilizzare un tracciante, cioè un reattivo che, partecipando alla reazione An-Ab in opportune condizioni, ne permetta la rivelazione sensibile. An + Ab An-Ab

23 LABEL Il tracciante deve essere una molecola caratterizzata da un elevato rapporto segnale/massa. Questo permette di ottenere un segnale altamente rivelabile anche in presenza di piccole quantità di tracciante, abbassando il limite di rivelazione del metodo. Isotopi radioattivi (125I, 3H) Molecole fluorescenti - fluorescenza convenzionale (fluoresceina, rodamina) - fluorescenza a risoluzione temporale (chelati di ioni lantanidi: Eu3+, Tb3+) - fluorescenza polarizzata (fluoresceina) Molecole chemiluminescenti (luminolo, esteri di acridinio) Enzimi (perossidasi, fosfatasi alcalina, b-galattosidasi) determinabili con substrati - cromogenici - fluorescenti - chemiluminescenti

24 Tracciante: limite di rivelazione
SCELTA DEL LABEL Tracciante: limite di rivelazione Il tracciante deve essere presente nel tubo ad una massa estremamente bassa ( g) e facilmente rivelabile TRACCIANTE SEGNALE MASSA (moli/tubo) 125I ≈ dpm 0.1 – 10 x 10-15 Enzima Assorbanza 10-15 – 10-16 Luminescenza 10-16 – 10-18 Fluorescenza 10-15 – 10-18 Amplificazione ciclica enzimatica 10-20 – 10-21 Molecola fluorescente I fluorescenza 10-18 – 10-19 Molecola chemiluminescente mV

25 METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA)
Perché è vantaggioso utilizzare un enzima come marcatore per la sintesi di un tracciante? L’attività catalitica dell’enzima permette di amplificare il segnale analitico (un solo enzima genera moltissime molecole di prodotto). Il limite di rivelazione del metodo è quindi significativamente inferiore rispetto ai metodi basati sull’uso di substrati enzimatici o molecole fluorescenti o chemiluminescenti come marcatori. S E La molecola di substrato utilizzata come marcatore produce una sola molecola di prodotto per ogni molecola di tracciante L’enzima utilizzato come marcatore produce molte molecole di prodotto per ogni molecola di tracciante

26 METODI IMMUNOENZIMATICI (EIA)
Vantaggi relativi all’uso di enzimi: sono facilmente reperibili in forma pura, relativamente economici e stabili; sono disponibili numerose metodiche semplici ed automatizzabili per la misura dell’attività enzimatica; una molecola di enzima può produrre moltissime molecole di prodotto; è possibile ottenere la modulazione dell’attività enzimatica in seguito al legame con l’anticorpo, permettendo lo sviluppo di EIA omogenei. Svantaggi relativi all’uso di enzimi: l’attività enzimatica può variare in funzione della temperatura o della presenza di interferenti; la coniugazione chimica dell’enzima può ridurne l’attività specifica; si può avere rumore di fondo dovuto alla presenza di enzima nel campione.

27 TRACCIANTI ENZIMATICI
SISTEMA DI RIVELAZIONE METODOLOGIA ANALITICA Perossidasi H2O2/cromogeno Spettrofotometria H2O2/luminolo Chemiluminescenza Fosfatasi alcalina 4-nitrofenilfosfato Spettrofotometria 4-metilumbelliferone-fosfato Fluorimetria AMPPD Chemiluminescenza -galattosidasi 2-nitrofenolo Spettrofotometria 4-metilumbelliferone Fluorimetria 2-naphthyl--D-galactopyranoside Chemiluminescenza La misura dell’attività enzimatica viene comunemente effettuata utilizzando un substrato che viene trasformato dall’enzima in prodotto colorato, il quale viene poi misurato tramite spettrofotometria. L’uso di substrati fluorescenti o chemiluminescenti permette di ridurre il limite di rivelazione del metodo.

28 MARCATORI DEI SAGGLI IMMUNOCHIMICI IN CHIMICA CLINICA
Enzimi (Metodi EIA) Fluorofori Molecole chemiluminescenti Sistemi bioluminescenti Fosfatasi alcalina, Galattosidasi, Glucosio ossidasi, Lisozima, Perossidasi di rafano (HRP) Fluorescina Chelati di europio Luminolo, Rutenio, Europio Luciferasi/luciferina

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30 Le più comuni applicazioni dei metodi immunometrici in chimica analitica clinica riguardano la determinazione di: ormoni nei fluidi biologici (sangue, urina, saliva) farmaci nel siero e nelle urine (antiepilettici, antidepressivi, cardioattivi, immunosoppressivi, antibiotici, ecc...) droghe d’abuso nei fluidi biologici (oppiacei, allucinogeni, cannabinoidi, cocaine) Immunoglobuline nel sangue, IgE e allergeni vari e IgD nel siero, proteine di derivazione tubulare e glomerulare nelle urine Interleuchine diagnosi di Helicobacter pylori, Herpes, Rubella, Brucella, Toxoplasma, Epatite

31 SENSIBILITA’ DEI METODI IMMUNOMETRICI

32 INTERFERENZE NEI METODI IMMUNOMETRICI
I metodi immunometrici sono soggetti ad interferenze, soprattutto per quanto riguarda la reazione immunologica e la rivelazione del segnale. Le cause più comuni sono: la presenza nel campione di molecole che danno reazione crociata con l’anticorpo o che interferiscono con la formazione del complesso antigene-anticorpo o che competono con l’anticorpo per il legame con l’antigene (es proteine del siero, autoanticorpi, anticorpi eterofili, anticorpi umani anti-topo, eccesso di anigene), ecc; la presenza nel campione di enzima endogeno (nel caso di EIA), di molecole colorate o fluorescenti (nel caso di rivelazione spettrofotometrica o fluorescente), ecc. Questo fenomeno può essere notevolmente ridotto adottando un metodo eterogeneo, grazie ai lavaggi effettuati prima della misura.

33 Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP)
L’efficienza dell’assorbimento della luce da parte di un fluoroforo dipende dall’angolo tra il dipolo elettronico della luce eccitatrice e l’oscillatore nella molecola. Una luce polarizzata su un piano ecciterà in maniera efficiente solo quelle molecole che hanno i loro oscillatori orientati opportunamente (di solito parallelamente) rispetto al piano della luce eccitatrice. Se il fluoroforo è fermo, il piano di polarizzazione della luce emessa sarà parallelo a quello della luce assorbita. luce assorbita luce emessa fluoroforo

34 Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP)
Il grado di polarizzazione della radiazione emessa dipende dal tempo di emivita dello stato eccitato ( ) e dal movimento rotatorio della molecola. Se il tempo richiesto al fluoroforo per ruotare è confrontabile con , esso cambierà posizione prima di emettere fluorescenza e quindi la luce emessa perderà parzialmente o completamente la polarizzazione. fluoroforo fisso fluoroforo libero di ruotare La polarizzazione viene mantenuta La polarizzazione viene persa

35 Metodi basati su misure di Fluorescenza Polarizzata (FP)
Una grossa molecola (anticorpo) ha un tempo di movimento di circa ns, mentre una piccola molecola (farmaco) di circa 0,1-1 ns. In condizioni di eccitazione costanti l’emissione polarizzata sarà funzione delle dimensioni del fluoroforo e del rapporto tra tempo di rilassamento rotazionale e tempo di decadimento della fluorescenza. L’analita è marcato con una molecola fluorescente. Mediante misure di FP è possibile misurare la frazione di tracciante legato all’anticorpo in fase omogenea. Infatti il tracciante legato mantiene un grado di polarizzazione maggiore rispetto al tracciante libero. Perché ciò si verifichi, il tempo di decadimento della fluorescenza deve essere più lungo del tempo di rotazione del farmaco e più breve del tempo di rotazione del complesso antigene-anticorpo.

36 METODI IMMUNOMETRICI E FLUORESCENZA RISOLTA NEL TEMPO
(DELFIA) Forme chelate dei lantanidi con tempi di decadimento della fluorescenza lunghi ( ms) Breve durata della fluorescenza dei materiali biologici naturali (1-20 ns)

37 METODI IMMUNOMETRICI E ELETTROCHEMILUMINESCENZA (I)
Il complesso di rutenio, solitamente utilizzato come marcatore, non si consuma durante la reazione (a differenza dell’ammina alifatica), svolgendo quindi un ruolo paragonabile a quello di un enzima. fotone (l ~ 620 nm) Ru(bpy)32+ Ru(bpy)32+* prodotti TPA: tripropilammina - H+ TPA● Ru(bpy)33+ Ru(bpy)32+ TPA TPA+ e- e-

38 METODI IMMUNOMETRICI E ELETTROCHEMILUMINESCENZA (II)
Dal punto di vista analitico, l’ECL è particolarmente interessante in confronto ai normali sistemi chemiluminescenti, in quanto: La reazione chemiluminescente può essere facilmente controllata mediante applicazione di un opportuno potenziale Il rapporto segnale/rumore di un sistema ECL è di solito maggiore di quello dei sistemi chemiluminescenti “chimici” basati su catalizzatori enzimatici o su molecole spontaneamente chemiluminescenti.

39 METODI IMMUNOMETRICI E ELETTROCHEMILUMINESCENZA (III)
VANTAGGI: E’ una reazione ciclica e quindi può essere considerata un sistema amplificato Può essere “accesa” e “spenta” (la reazione avviene solo se avviata elettrochimicamente) Non ha segnale di fondo Per questi motivi è abbastanza diffusa nei sistemi automatizzati di analisi clinica (uno dei sistemi attualmente in commercio combina la chemiluminescenza elettrogenerata con l’usi di supporti magnetici sui quali sono immobilizzati gli anticorpi per attuare metodi immunimetrici eterogenei con rivelazione chemiluminescente)

40 METODI IMMUNOMETRICI E ELETTROCHEMILUMINESCENZA (IV)
Analizzatore Elecsys, prodotto dalla Roche Elettrodi per la produzione del segnale ECL magnete Fasi di reazione e lavaggio: microsfere in sospensione Fasi di eliminazione della soluzione: microsfere trattenute dal magnete

41 METODI IMMUNOMETRICI E ELETTROCHEMILUMINESCENZA (V)
Sono a tutt’oggi disponibili oltre 50 metodi immunometrici per sistemi Elecsys:

42 COMPLESSO AVIDINA-BIOTINA
IMMUNODOSAGGI MEDIANTE IL COMPLESSO AVIDINA-BIOTINA biotina avidina enzima MARCATURA CON IL COMPLESSO AVIDINA-BIOTINA TECNICA DEL PONTE AVIDINA-BIOTINA

43 METODI OMOGENEI ED ETEROGENEI
Eterogenei (su fase solida): (i metodi EIA eterogenei sono ELISA=enzyme linked immunoadsorbent immunoassay) determinazione delle IgE, IgG e immunocomplessi. Determinazione di ormoni, insulina. Diagnosi di malattie infettive. Determinazione di antigeni di superficie delle epatiti. Omogenei (in fase liquida): - determinazione di farmaci o droghe nell’urina (anfetamine, barbiturici, metadone, oppiacei) e nel plasma (digossina, Fenobarbital).

44 METODI OMOGENEI ED ETEROGENEI
CARATTERISTICHE Metodi eterogenei Poco sensibile all’interferenza della matrice del campione Molto sensibile all’interferenza della matrice del campione Ampio ambito dinamico del metodo Ambito dinamico del metodo inferiore Bassi limiti di rivelazione Limiti di rivelazione più elevati Difficili da automatizzare Possono essere automatizzati facilmente Esecuzione del metodo più complicata Esecuzione semplice e rapida Metodi omogenei

45 COME SI OTTIENE UN ANTICORPO
Un anticorpo specifico per l’analita si ottiene immunizzando un animale da laboratorio con l’analita stesso. L’analita è un antigene in grado di stimolare una risposta immunitaria solo se ha una massa relativamente elevata (PM > 1000 Da). La regione di antigene che si trova in contatto diretto con l’anticorpo è detta epitopo o determinante antigenico. Mediante l’immunizzazione di un animale da laboratorio si ottiene un antisiero contenente una popolazione eterogenea di anticorpi policlonali, diretti verso i diversi epitopi dell’antigene e caratterizzati da diverse affinità. È anche possibile ottenere anticorpi monoclonali, cioè una popolazione omogenea di anticorpi diretti verso un unico epitopo.

46 ANTICORPI POLICLONALI E MONOCLONALI (II)
IBRIDOMA: mantiene la capacità della cellule della milza di produrre anticorpi, associata alla vitalità della cellule di mieloma. Antisiero policlonale Anticorpi monoclonali

47 POSSIBILI FORMATI ANALITICI: lateral-flow immunoassay
Permettono un’analisi qualitativa o semi-quantitativa molto rapida S T C Negativo Positivo

48 LATERAL-FLOW IMMUNOASSAY
DETERMINAZIONE SEMIQUANTITATIVA DELLA MICROALBUMINA NELLE URINE Principio immunologico: anticorpi monoclonali specifici per l'albumina umana (immunoglobulina G) Marcatore: oro colloidale Linearità: da negativo a 100 mg/l Intervalli di lettura:    - da negativo a 20 mg/l    - da 20 a 50 mg/l    - da 50 a 100 mg/l    - superiore a 100 mg/l Stabilità del colore di reazione: fino a 5 minuti Performance del test:    - sensibilità: 95 % a 15 mg/l; 97% a 20 mg/l    - specificità: 93% a 15 mg/l; 72% a 20 mg/l    - valore predittivo positivo: 97% a 15 mg/l; 84% a 20 mg/l    - valore predittivo negativo: 88% a 15/mg/l; 94% a 20 mg/l Stabilità test confezionato: 18 mesi dalla data di confezionamento Temperatura di conservazione del flacone: compresa tra +2 °C e + 30 °C Fattori di interferenza:    - nel raccoglitore urine: disinfettanti ad alto potere ossidante    - nel campione: presenza di ossitetraciclina (incremento dei valori del 15%) Certificazione ISO Conformità direttiva 98/79/CEE

49 LATERAL-FLOW IMMUNOASSAY DEVICE
Sample port Sample pad Reagent zone Target analyte zone Control zone waste membrane

50 POSSIBILI FORMATI ANALITICI: piastre microtiter
In commercio sono disponibili numerosi kit su piastra microtiter a 96 pozzetti, spesso con traccianti enzimatici e rivelazione colorimetrica. Il kit contiene la piastra con l’anticorpo immobilizzato e tutti i reagenti pronti all’uso. E’ necessario disporre di pipette per la dispensazione e di alcune attrezzature (lettore di micropiastre per la misura del segnale ed eventualmente dispensatori, lavatori, ...)

51 METODI IMMUNOMETRICI IN CHIMICA CLINICA
Sono commercialmente disponibili numerosissimi kit per analisi immunometrica, tipicamente con rivelazione colorimetrica, che permettono anche a laboratori piccoli e relativamente poco attrezzati di sfruttare i vantaggi di queste tecniche utilizzando strumentazione poco costosa.

52 METODI IMMUNOMETRICI IN CHIMICA CLINICA

53 METODI IMMUNOMETRICI IN CHIMICA CLINICA

54 METODI IMMUNOMETRICI IN CHIMICA CLINICA

55 METODI IMMUNOMETRICI IN CHIMICA CLINICA
Quanto costa un’analisi immunometrica? - Kit immunometrico per analisi del progesterone: 80 € (permette di effettuare 40 analisi in duplicato → 2 €/analisi) - Spettrofotometro per micropiastre con filtri per le adeguate lunghezze d’onda: € - Altra attrezzatura indispensabile per l’analisi (micropipette, vortex, ecc.): € - Materiali “disposable” (provette, puntali, ecc.): € per ogni kit utilizzato - Tempo richiesto per l’analisi, includendo i tempi necessari per la preparazione dei campioni ed i tempi di incubazione: 3-4 ore per 40 campioni

56 TRASFORMAZIONE LOGIT/LOG
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI (V) LINEARIZZAZIONE DELLA CURVA DOSE-RISPOSTA DI UN METODO COMPETITIVO TRASFORMAZIONE LOGIT/LOG La trasformazione logit/log consiste nello “stiramento” della sigmoide che approssima la curva dose-risposta in uno spazio semilogaritmico e permette di linearizzare la porzione centrale della curva.

57 METODI COMPETITIVI: INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI (II)
Limite di rivelazione Calcolato in funzione della deviazione standard di B0 Sensibilità pendenza della curva Midrange Concentrazione corrispondente a B/B0 50% B/B0 log concentrazione analita Intervallo dinamico Convenzionalmente compreso fra B/B0 90% e B/B0 10%

58 METODI NON COMPETITIVI ETEROGENEI: UN ESEMPIO
DTERMINAZIONE DELLA FERRITINA NEL SIERO UMANO + + Ab anti-ferritina marcato con HRP Ab monoclonali ani-ferritina Ferritina presente nel campion/stadards/controllo 60 min 37 °C + 30 min 25 °C Lettura del segnale a 492 nm Colorazione giallo-arancione

59 POSSIBILI FORMATI ANALITICI: analizzatori automatici
Laboratori di grosse dimensioni utilizzano analizzatori automatici che, una volta inserito il campione, eseguono automaticamente le procedure di calibrazione, analisi del campione ed elaborazione dei dati. Abbott TDx

60 Rivelazione USO DI PARTICELLE DI POLISTIRENE PER METODI IMMUNOMETRICI
(es:PACIA - Particle Counting Immunoassay o misure di diffusione) Rivelazione

61 DIRECT ELISA a)Apply Antigen d)Wash Plate
1. Add 100 ml antigen diluted in coating solution to appropriate wells. 2. Incubate overnight at 4° C. 3. Empty plate and tap out residual liquid b)Block Plate 1. Add 300 ml blocking solution to each well. 2. Incubate 15 minutes, empty plate and tap out residual liquid. c)Add Antibody Conjugate Solution 1. Add 100 ml antibody conjugate solution to eachwell. 2. Incubate 1 hour at room temperature 3. Empty plate, tap out residual liquid. d)Wash Plate 1. Fill each well with wash solution. 2. Incubate 10 minutes RT. 3. Empty plate, tap out residual liquid. 4. Repeat 3-5 times. e)React with Substrate 1. Dispense 100μl of substrate into each well. 2. After sufficient color development, add 100 ml stop solution to each well. 3. Read plate with plate reader using appropriate

62 INDIRECT ELISA d)Wash Plate 1. Fill each well with wash solution.
2. Incubate 10 minutes RT. 3. Empty plate, tap out residual liquid. 4. Repeat 3-5 times. e)Add Secondary Antibody Conjugate Solution 1. Add 100μl diluted secondary antibody conjugate to each well. 2. Incubate 1 hour RT. 3. Empty plate, tap out residual liquid and wash as above. f)React with Substrate 1. Dispense 100μl substrate into each well. 2. After sufficient color development, add 100ul of stop solution to each well. 3. Read plate with plate reader. a)Apply Antigen 1. Add 100μl antigen diluted in coating solution to appropriate wells. 2. Incubate overnight at 4° C. 3. Empty plate and tap out residual liquid. b)Block Plate 1. Add 300μl blocking solution to each well. 2. Incubate 15 minutes, empty plate and tap out residual liquid. c)React with Primary Antibody 1. Add 100μl diluted primary antibody to each well. 2. Incubate 1-2 hours. 3. Empty plate, tap out residual liquid.

63 SANDWICH/CAPTURE ELISA
d)Wash Plate 1. Fill each well with wash solution. 2. Incubate 10 minutes RT. 3. Empty plate, tap out residual liquid. 4. Repeat 3-5 times. e)Add Secondary Antibody Solution 1. Add 100μl diluted secondary antibody to eachwell. 2. Incubate 1 hour RT. 3. Empty plate, tap out residual liquid and wash as above. f)React with Substrate 1. Dispense 100μl substrate into each well. 2. After sufficient color development, add 100μl stop solution into each well. 3. Read with plate reader. a)Apply Capture Antibody 1. Add 100μl capture antibody diluted in coating solution to appropriate wells. 2. Incubate 1 hour RT. 3. Empty plate, tap out residual liquid. b)Block Plate 1. Add 300μl blocking solution to each well. 2. Incubate 15 minutes, empty plate, tap out residual liquid. c)React Sample Antigen 1. Add 100μl diluted antigen to each well.

64 VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI
Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Elevata specificità di riconoscimento tra Ag e Ab Campioni fluidi (siero, urina, latte) ANALISI DIRETTA Campioni solidi (carne, matrici vegetali, tessuti) OMOGENEIZZAZIONE ESTRAZIONE ANALISI

65 VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI
Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Impiego di traccianti, cioè reattivi biospecifici con elevato rapporto segnale/massa Traccianti: Ag o Ab coniugati chimicamente con un marcatore (“label”)  Piccoli volumi di campione  Piccoli volumi di reagenti (riduzione dei costi)  Diagnosi precoce  Determinazione di sostanze in tracce

66 VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI
Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Impiego di piastre microtiter a 96 o 384 pozzetti Analisi di numerosi campioni (ca. 40 o 200 in duplicato) nella stessa seduta analitica Rapidità di esecuzione (poche ore) Analisi di numerosi campioni per giorno

67 VANTAGGI DEI METODI IMMUNOMETRICI
Elevata specificità Basso limite di rivelazione Alta produttività analitica Possibilità di automazione Disponibilità di dispensatori, lavatori, lettori ed elaboratori del segnale automatici Ottimizzazione delle fasi analitiche errori precisione e accuratezza tempi di esecuzione rapidità