Lezione 13 - 14 martedì 19 Marzo 2011 corso vettori biologici II Biotec industriali ore 14:00 -16:00 aula 6A.

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1 Lezione 13 - 14 martedì 19 Marzo 2011 corso vettori biologici II Biotec industriali ore 14:00 -16:00 aula 6A

2 la doppia elica da e riceve informazioni l’informazione genetica non procede a senso unico dal genoma verso il nucleo - citoplasma - matrice - e ambiente, è vero anche il contrario perchè il genoma deve essere pronto a ricevere messaggi dall’ambiente in cui si trova le cellula: questa è la regolazione

3 Si può intervenire sulla regolazione ? Quali possono essere le strategie e le tecniche? - La maggior parte dei vettori servono per esprimere o far esprimere dei geni - Si conoscono ancora pochi sistemi e pochi meccanismi che non siano legati direttamente all’attività di un singolo gene - I metodi utilizzati ricorrono a sostituzioni o delezioni di promotori o enhancers - a livello genomico non ci sono molti esperimenti controllati - ci sono casi con macrodelezioni o inversioni cromosomiche ma se sono vitali è difficle capire quanti e quali funzioni alterino

4 le nuove prospettive Manipolazioni genomiche più vaste o sono state fatte tramite inserzioni in regioni regolative o tramite delezioni estese Più recentemente sono stati adottati vasti BAC con intere regioni da inserire nel genoma di cellule ed in animali transgenici per verificare il fenotipo o solamente l’espressione dei geni presenti nel BAC ed espressi autonomamente prescindendo dalle funzioni endogene Si tratta della sola possibilità di studio di un cluster Con gli studi sulle cellule staminali si cominciano ad avere studi su sistemi di controllo superiore, cioè su sitemi a monte che controllano livelli più alti della regolazione

5 falsi problemi Assolutamente importante: va considerato che a qualunque stadio differenziativo di una cellula o di un organismo ci sarà sempre una serie di geni espressi col loro turn-over con il metabolismo di base identico - geni house keeping - marcatori di membrana (da noi considerati segnali di differenziamento a volte con una funzione non ancora identificata) - quindi solo una certa parte del genoma sarà attiva specifica dello stadio e del tessuto - nella progressione è nostra l’attribuzione del livello superiore di controllo, ma solamente perché temporalmente è precedente allo stadio successivo di differenziamento - il sistema è ciclico (come la tavola rotonda non ha capotavola)

6 Prove di staminalità per poter controllare la staminalità le prove possibili erano di mimare l’espressione dei geni identificati per non essere espressi in altre condizioni simultaneamente - la prova essenziale è dimostrare tramite espressione di geni la reversibilità degli stadi differenziativi - trovare questi geni darebbe la possibilità di poter studiare i meccanismi retrogradi del differenziamento più del livello così detto superiore di controllo - si tratta di trovare la temporalità nell’espressione con i passaggi della modulazione delle varie fasi - alcuni passaggi a cascata non possono essere ripercorsi come il passaggio da linfocita a plasmacellula (dopo il riarrangiamento somatico non ci può essere più recupero)

7 Molti tumori in varie fasi Infatti non da ogni tipo di cellula può scaturire una neoplasia - alcuni geni non possono essere attivati senza far perdere funzioni essenziali per la sopravvivenza della cellula stessa - alcune funzioni possono essere conflittuali - per poter intervenire artificialmente devono esserci strategie più mirate che tengano conto di possibili interazioni evidenziate da studi così detti throughput - questi studi permettono di analizzare il controllo di molti geni contemporaneamente

8 usi classici dei plasmidi dai clonaggi e subclonaggi per analisi più fini e sequenziamento le libraries di DNA genomico e cDNA (trascrittoma) i vettori di espressione in E.coli o eucarioti sistemi con promotori costitutivi o inducibili negli eucarioti i plasmidi non si replicano trasfezione transiente o stabile la trasfezione stabile avviene tramite integrazione del vettore

9 Fino a qui metodi classici Con questi tipi di vettori si è potuto usare il metodo ormai classico : - enzimi di restrizione - ligasi da quando è stata inventata (non scoperta) la PCR è stata utilizzata parzialmente o totalmente in sostituzione di questa metodologia comunque efficiente - limitazione ai siti di taglio riconosciuti degli enzimi - in certi casi sono aggiunti o tolti per mutagenesi sito specifica i siti di taglio di consensus dell’enzima voluto

10 per proseguire si deve conoscere a fondo la PCR: la PCR è una derivazione o applicazione del sistema naturale della sintesi del DNA in natura c’è solo la sintesi del DNA per duplicarlo prima della mitosi questa tecnica amplifica quantità di DNA specifiche e limitate in lunghezza in maniera logaritmica raddoppiando il templato ad ogni amplificazione

11 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1959 "for their discovery of the mechanisms in the biological synthesis of ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid" Severo Ochoa Arthur Kornberg half 1/2 of the prize New York University b. 1905 (in Luarca, Spain) d. 1993 College of Medicine Stanford University CA, USA b. 1918 d. 2007 il figlio Roger ha vinto il Nobel nel 2006 per aver scoperto il meccanismo di trascrizione negli eucarioti tramite l’mRNA poly II le basi erano precedenti

12 Kerry Mullis stated “lets you pick the piece of DNA you’re interested in and have as much of it as you want”. 1983 The double-stranded DNA was separated into two single strands by heating it to 96°C. At this temperature, however, the E.Coli DNA polymerase was destroyed so that the enzyme had to be replenished after the heating stage of each cycle. Mullis's original PCR process was very inefficient since it required a great deal of time, vast amounts of DNA-Polymerase, and continual attention throughout the PCR process. La polimerasi era il punto debole cruciale della nuova tecnica inizio difficile

13 However, higher annealing temperatures were not established until the single “most important development of PCR development”, the cloning, purification and commercial distribution of a heat-resistant DNA polymerase from the thermophilic bacterium Thermus aquaticus (Taq) in 1988. The PCR group tested several different thermophillic bacterial species, and eventually settled on Thermus aquaticus, a strain of bacteria which had been discovered living in Yellowstone hot springs. Because the bacteria lived in water that often approached boiling conditions, its polymerase enzyme had no problem remaining functional at the PCR temperatures seconda intuizione geniale

14 Kary Banks Mullis, Ph.D. (born December 28, 1944) is an American biochemist and Nobel laureate. Mullis shared the 1993 Nobel Prize in Chemistry with Michael Smith. Mullis received the prize for his development of the Polymerase Chain Reaction (PCR), a reaction first described by Kjell Kleppe and 1968 Nobel laureate H. Gobind Khorana that allows the amplification of specific DNA sequences. The improvements provided by Mullis have made PCR a central technique in biochemistry and molecular biology. Mullis also received the Japan Prize in 1993. il premio Nobel in Chimica

15 Metodo vagheggiato già da tempo I premi Nobel Kornberg dello studio delle DNA polimerasi sapevano che avendo a disposizione una DNA polimerasi sarebbe stato possibile sintetizzare del DNA, ma sempre e solo su un templato: extenction - la sintesi ex novo pareva un miraggio e anche la rapida amplificazione di grosse quantità

16 la PCR e le sue applicazioni la tecnica in cosa consiste PCR (Polymerase Chain Reaction) è una tecnica atta ad amplificare in provetta frammenti di DNA di cui siano note le due estremit à. Inventata da Kerry Mullis nel 1983 (premio Nobel nel 1993), fu resa efficiente nel 1988 grazie all ’ uso dell ’ enzima Taq DNA polymerase del batterio Thermus aquaticus, resistente ad alte temperature. Questa tecnica è diventata indispensabile nella biologia per le tante applicazioni anche in medicina diagnostica. Con la PCR è possibile amplificare ed isolare uno specifico segmento di DNA (amplicone) dal genoma di specie viventi o da un DNA artificiale o clonato. Le dimensioni dell ’ amplicone possono variare da poche decine di paia di basi fino ad un massimo di 15-20 mila paia di basi (un cromosoma ha una lunghezza di milioni di paia di basi). L ’ amplificazione avviene grazie a cicli successivi di sintesi del segmento di DNA, delimitato da due primers o inneschi sintetici (frammenti a singola elica di DNA lunghi ~15-25 basi) complementari alle sue estremit à.

17 come è la tecnica amplificazione diretta: come si setta un protocollo le fasi della PCR temperature durata e numero dei cicli scelta dei primers

18 le basi della PCR Polimerase Chain Reaction reazione di polimerizzazione a catena amplificazione esponenziale del DNA (di qualunque provenienza) amplificazione in vitro del DNA tramite una DNA polimerasi

19 Ricordare per sempre: Le polimerasi sintetizzano DNA o RNA in direzione 5’ 3’ a partire da un innesco 3’ libero su un templato. Il DNA e’ una molecola a doppia elica, le due eliche sono antiparallele, la sintesi avviene sempre nella stessa direzione per ognuna delle eliche, quindi in verso opposto su ognuna di esse, ma sempre 5’ 3’ La polimerasi poiche’ sintetizza in direzione 5’ 3’ scorrera’ sulla elica di DNA templato in direzione 3’ 5’ Come sintetizza la polimerasi

20 i vari passaggi per sintetizzare in vitro il DNA la sintesi con la polimerasi avviene sulla singola elica tramite un innesco (“primer”) appaiato per complementarietà alla elica che funziona da templato 1 passaggio: denaturazione della doppia elica di DNA 2 passaggio: appaiamento dei “primers” sul templato ssDNA 3 passaggio: sintesi ed estenzione della nuova elica a partire dal primer ad opera della Taq-polimerase il ciclo è terminato e ricomincia ma come funziona la PCR ?

21 perchè all’inizio era difficile la PCR ? non solo per l’inattivazione della polimerasi di E.coli al passaggio della denaturazione del DNA a 94°C ma per i successivi passaggi alle diverse temperature se i passaggi sono lenti i primers si possono appaiare anche ad altre sequenze genomiche dando amplificazioni aspecifiche indesiderate necessità di una macchina rapida nei passaggi di temperatura invenzione del termociclatore ad aria invece dei bagni Maria 3 passaggi a 3 temperature

22 PCR “polymerase chain reaction” Descrizione della tecnica, metodo, componenti, variabili, strumenti = termociclatori Tecnica: amplificazione esponenziale a cicli successivi tramite DNA polimerasi (adesso e’ termo resistente) DNA polimerasi di “thermophilus aquaticus” (Taq polimerasi) - salto di qualita’ del metodo, molto piu’ efficiente. Le applicazioni si sono moltiplicate nella ricerca biologica e medica, nella diagnostica e medicina forense (legale) Il principio sfrutta l’efficienza (velocita’ di sintesi) della DNA polimerasi utilizzando due inneschi (primers) artificiali scelti dallo sperimentatore sulla sequenza da amplificare (modo esponenziale). La reazione a catena della DNA polimerasi