BIOCHIMICA ENOLOGICA Programma: Ossidazioni e fermentazioni. Catabolismo glicidico e produzione di energia. Significato, sede e fasi della via glicolitica.

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1 BIOCHIMICA ENOLOGICA Programma: Ossidazioni e fermentazioni. Catabolismo glicidico e produzione di energia. Significato, sede e fasi della via glicolitica. Glicolisi aerobia e glicolisi anaerobia: stechiometrie e bilanci energetici. Effetto Pasteur. Effetto Crabtree. Tappe ed enzimi della glicolisi. Glicolisi aerobia e ciclo di Krebs: bilancio energetico. Glicolisi anaerobia: da piruvato ad etanolo. Significato e tappe della fermentazione etanolica. Gli enzimi della fermentazione etanolica. Induzione dell’alcol-deidrogenasi. Repressione da glucosio degli enzimi mitocondriali. Glicolisi anaerobia: significato ed enzimi della fermentazione lattica. NADH citoplasmatico e mitocondriale. I sistemi navetta. Vie alternative alla fermentazione etanolica: formazione di glicerolo; formazione di acido acetico. Prodotti secondari della fermentazione etanolica. Fermentazione malo-lattica. Fermentazione malo-alcolica. Vie alternative alla glicolisi: shunt dell’esoso-monofosfato. Fermentazione omolattica ed eterolattica. Metabolismo dell’acido malico, dell’acido succinico e dell’acido tartarico. Metanolo e alcoli superiori: origine. Sostanze pectiche dell’uva e del vino (pectinasi; presa di spuma). Origine e significato delle amine biogene nel vino. Principali aldeidi, chetoni ed esteri di interesse enologico. Composti fenolici dell’uva e del vino. Tannini condensati e tannini idrolizzabili. Specie chimiche ed equilibri dell’anidride solforosa nel vino. Reazioni dell’anidride solforosa con i composti organici dell’uva e del vino e con la vitamina B1. Metalli nel vino: problemi enologici e salutistici. Principali tappe biochimiche nella birrificazione. Testi di base: Testo adottato: I.Cozzani, E.Dainese: Biochimica degli alimenti e della nutrizione, Ed. Piccin Nuova Libraria, PD 2006. U. Leuzzi, E. Bellocco, D. Barreca: Biochimica della nutrizione, Ed. Zanichelli (BO). A.L.Lehninger, D.L.Nelson, M.M.Cox: Principi di Biochimica, Ed. Zanichelli (BO). D.Voet, J.G.Voet: Biochimica, Ed. Zanichelli (BO). Approfondimenti: P.Ribereau-Gayon et al.: Handbook of enology, Ed. J.Wiley& Sons, ltd.

2 Bioenergetica e tipi di reazioni biochimiche

3 BIOENERGETICA E METABOLISMO
FUNZIONI: Ottenere energia chimica dall’ambiente catturando luce solare o degradando sostanze nutrienti ricche di energia; Convertire le molecole delle sostanze nutrienti nelle molecole caratteristiche della cellula stessa, compresi i precursori delle macromolecole; Polimerizzare precursori monomerici in macromolecole formando proteine, acidi nucleici e polisaccaridi; Sintetizzare e degradare le biomolecole necessarie per le funzioni specializzate della cellula, come ad esempio i lipidi di membrana, messaggeri intracellulari e pigmenti.

4 ORGANISMI AUTOTROFI (batteri fotosintetici, le alghe verdi e le piante vascolari)
Possono usare l’anidride carbonica dall’atmosfera come unica fonte di atomi di carbonio ORGANISMI ETEROTROFI (animali superiori e maggior parte di microorganismi) devono ottenere gli atomi di carbonio dall’ambiente sotto forma di molecole organiche relativamente complesse, come il glucosio

5 Fotosintesi Energia della luce + CO2 + H2O zuccheri + O2 + energia di calore

6 Fotosintesi e Respirazione

7 CICLO DELL’AZOTO NELLA BIOSFERA
Tutti gli organismi viventi hanno anche bisogno di una fonte di atomi di azoto, elemento necessario per la sintesi degli amminoacidi, dei nucleotidi e di altri tipi di composti: Ammoniaca o nitrati solubili per piante e batteri Amminoacidi o altri composti azotati per i vertebrati

8 VIE CATABOLICHE E ANABOLICHE
Le vie cataboliche rilasciano energia (conservata sotto forma di ATP e di trasportatoti di e- NADH, NADPH e FADH2) e una parte rimanente sotto forma di calore Le vie anaboliche hanno bisogno di energia sotto forma del potenziale di trasferimento del gruppo fosforico dell’ATP e del potere riducente di NADH, NADPH e FADH2

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10 TERMODINAMICA NEI SISTEMI BIOLOGICI
BIOENERGETICA: studio quantitativo delle trasduzioni energetiche (cambiamenti dell’energia da una forma ad un’altra). 1° legge della termodinamica: in qualsiasi modificazione chimica o fisica, la quantità totale di Energia nell’universo resta costante; l’energia può cambiare forma o essere trasferita da una zona ad un’altra, ma non può essere né creata né distrutta. 2° legge della termodinamica: in tutti i processi naturali, l’entropia tende ad aumentare ovvero l’universo tende ad essere sempre più disordinato Le tre entità termodinamiche: ENERGIA LIBERA DI GIBBS, G e variazione di energia libera ΔG (valore positivo: reazione endoergonica il sistema guadagna energia; valore negativo: reazione esoergonica la reazione procede con rilascio di energia) ENTALPIA, H (contenuto termico) e ΔH (valore positivo: reazione endotermica un sistema chimico assume calore; valore negativo: reazione esotermica la reazione chimica rilascia calore ) ENTROPIA, S espressione quantitativa della casualità e del disordine di un sistema

11 La forza trainante di una reazione è ΔG, la variazione di energia libera, che rappresenta l’effetto netto dei due fattori: ΔG = ΔH - T ΔS. La variazione di energia libera standard, ΔG°, è una costante fisica caratteristica per una determinata reazione ed è calcolata dalla costante di equilibrio con la reazione: ΔG elevato e negativo: la reazione procede In avanti ΔG elevato e positivo: la reazione tende a procedere nella direzione opposta ΔG=0 il sistema è all’equilibrio

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14 La maggior parte di reazioni che si svolgono nella materia vivente appartiene ad una delle seguenti cinque categorie generali: Reazioni che formano un legame carbonio-carbonio, o che lo spezzano; Riarrangiamenti interni, isomerizzazioni ed eliminazioni; Reazioni che implicano la formazione di radicali liberi; Trasferimenti di gruppi chimici; Ossidoriduzioni.

15 Due meccanismi coinvolti in un legame C-C o C-H
PRINCIPI CHIMICI DI BASE Un legame covalente consiste di una coppia di elettroni condivisi e può essere scisso in due modi: Due meccanismi coinvolti in un legame C-C o C-H

16 I nucleofili e gli elettrofili più comuni nelle reazioni biochimiche
2. Molte reazioni biochimiche coinvolgono interazioni tra nucleofili ed elettrofili I nucleofili e gli elettrofili più comuni nelle reazioni biochimiche ELETTROFILI: gruppi funzionali poveri di e- e che quindi li attirano NUCLEOFILI: gruppi funzionali ricchi di e- e capaci di donarli

17 Proprietà chimiche dei gruppi carbonilici
Ibrido di risonanza I gruppi carbonilici e le immine facilitano il movimento degli e- stabilizzando il carboanione adiacente Lo ione metallico o un acido generale (HA) rafforzano la capacità dei gruppi carbonili di attirare gli e-

18 Alcune reazioni che formano o spezzano il legame C-C nei sistemi biologici
Il carboanione agisce da nucleofilo mentre il carbonio del carbonile da elettrofilo

19 dagli elementi con cui condividono gli e-
Stati di ossidazione del carbonio nelle molecole biologiche che dipendono dagli elementi con cui condividono gli e-

20 Una reazione di ossidoriduzione
Ogni ossidazione è accompagnata da una riduzione, nella quale un accettore di e- acquista gli e- rimossi dall’ossidazione. Le reazioni di ossidazione in genere rilasciano energia

21 RUOLO DELL’ ATP NEL METABOLISMO
L’ATP è una molecola ricca di energia in quanto la sua unità trifosfato contiene due legami fosfoanidridici ad “alto contenuto energetico” L’idrolisi dell’ATP ad ADP + Pi libera una quantità di energia libera standard pari a –30.5 kJ/mol o -7.3 kcal/mol. L’ATP è in grado di cedere gruppi fosforici a numerosi intermedi metabolici, convertendoli nella forma attivata con livelli di energia libera tali da consentire a questi intermedi fosforilati di partecipare alle reazioni biosintetiche, che sono termodinamicamente favorevoli (ΔG°<0) -Una analoga reazione con un reagente in forma non fosforilata sarebbe termodinamicamente sfavorevole (ΔG°>0) La generazione di ATP è quindi necessaria per il funzionamento dei processi biosintetici

22 Come ottengono ATP i microrganismi?
RESPIRAZIONE: sintesi di ATP attraverso il sistema enzimatico della F0-F1 ATP sintasi, al termine della catena di trasporto degli elettroni; FOTOFOSFORILAZIONE: sintesi di ATP attraverso l’impiego di energia luminosa per creare una separazione di cariche; FOSFORILAZIONE A LIVELLO DI SUBSTRATO: consiste nel diretto trasferimento di un fosfato ad alto contenuto energetico da un composto fosforilato ad ADP per formare ATP

23 Le basi chimiche della grande variazione di energia libera
associata all’idrolisi dell’ATP

24 Idrolisi del fosfoenolpiruvato (PEP)
Altri composti fosforilati e tioesteri hanno un’energia libera di idrolisi molto elevata: Idrolisi del fosfoenolpiruvato (PEP) Reazione catalizzata dalla piruvato chinasi seguita dalla tautomerizzazione spontanea del prodotto, piruvato che diventa più stabile del reagente

25 Idrolisi dell’1,3-bisfosfoglicerato

26 Idrolisi della fosfocreatina
In tutte queste reazioni che liberano Pi, le diverse forme di risonanza che Pi può assumere rendono più stabile questo prodotto rispetto al reagente e contribuiscono ulteriormente a generare una variazione di energia libera standard negativa per le reazioni di idrolisi.

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28 L’Acetil-CoA Il coenzima A (acetilCoA) è un trasportatore universale di gruppi acetile. L’acetilCoA ha un elevato potenziale di trasferimento del gruppo acetile. Idrolisi dell’Acetil-CoA: basi chimiche L’Acetil-CoA è un tioestere, composto nel quale l’atomo di ossigeno del legame estere è sostituito da un atomo di zolfo; nei tioesteri non vi sono stabilizzazioni per risonanza comparabili agli esteri normali; la differenza di energia libera tra il tioestere ed i suoi prodotti di idrolisi stabilizzati per risonanza è superiore a quella tra gli esteri normali ed i loro prodotti di idrolisi.

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30 Idrolisi dell’acetil-coenzima A
L’acetil-Coenzima A è un tioestere con un’energia libera di idrolisi molto negativa. I tioesteri contengono un atomo di zolfo nella posizione in cui in un estere è presente un atomo di ossigeno

31 Energia libera di idrolisi dei tioesteri e degli esteri

32 L’idrolisi dell’ATP avviene in due fasi: es enzima glutammina sintetasi
La partecipazione dell’ATP a una reazione chimica viene spesso indicata con una singola freccia ma il processo è a due tappe come in figura: 1) un gruppo fosforico viene prima trasferito dall’ATP al glutammato quindi 2) viene sostituito da NH3 e il Pi viene rilasciato

33 Classificazione dei composti fosforilati in base alle loro energie libere
standard di idrolisi

34 Gli stati di ossidazione dell’atomo di carbonio nella biosfera

35 Le reazioni di ossido-riduzione
l flusso di elettroni nelle reazioni di ossido-riduzione è responsabile di tutto il lavoro prodotto dagli organismi viventi; Sono reazioni metaboliche di trasferimento di elettroni che implicano: 1. perdita di elettroni da una specie chimica che diventa ossidata; 2. acquisizione di elettroni da un’altra specie chimica che si riduce; La molecola che dona elettroni in una reazione di ossido-riduzione viene detta agente riducente, essa si ossida trasferendo elettroni all’altro substrato; la molecola che accetta gli elettroni viene detta agente ossidante; Quando due specie chimiche hanno una diversa affinità per gli elettroni, il flusso di elettroni procede spontaneamente in un circuito verso la specie chimica con maggiore affinità per gli elettroni, guidato da una forza proporzionala alla differenza tra le due affinità; La tendenza di un riducente a perdere elettroni è data dal potenziale standard di riduzione E‘

36 Trasferimento di elettroni
Gli elettroni vengono trasferiti da un donatore ad un accettore in quattro modi: direttamente come elettroni: (Fe2+ + Cu2+ ↔ Fe3+ + Cu); atomi di idrogeno (:H+ + e-), (AH2 + B ↔ A + BH2); ione idruro (H-); in combinazione diretta con un riducente organico come l’ossigeno. Un equivalente riducente corrisponde ad un singolo elettrone che partecipa ad una reazione di ossido-riduzione. Le sostanze nutrienti vanno spesso incontro a deidrogenazioni enzimatiche che coinvolgono due “equivalenti riducenti” per volta e l’ossigeno può accettare due “equivalenti riducenti”; l’unità di ossidazione biologica corrisponde per convenzione al passaggio di due equivalenti riducenti da un substrato all’ossigeno.

37 I potenziali di riduzione misurano l’affinità per gli elettroni
Quando due coppie redox coniugate sono presenti nella stessa soluzione il trasferimento di elettroni avviene spontaneamente e dipende dall’affinità relativa dell’accettore di elettroni di ogni coppia.  Il potenziale di riduzione standard o potenziale redox standard (E0), misura (in volt) questa affinità, relativamente all’elettrodo standard di idrogeno (misurato a 25°C; ogni soluto alla concentrazione di 1M ed ogni gas alla pressione di 1atm); lo stato standard biochimico è definito a pH 7 (E’0). Ogni valore rappresenta la differenza di potenziale che si genera quando la coppia coniugata redox viene collegata all’elettrodo standard di idrogeno. Gli elettroni tenderanno a fluire dalla coppia coniugata con il potenziale redox più basso a quella con il potenziale redox più elevato (più positivo) e questa tendenza è proporzionale alla differenza ΔE. I potenziali di riduzione standard permettono di calcolare la variazione di energia libera. La variazione di energia libera delle reazioni di ossido-riduzione è proporzionale al ΔE (differenza tra il valore di E dell’accettore e quello del donatore di elettroni) secondo la relazione: ΔG=-nZ ΔE, oppure ΔG’0=-nZ ΔE’0 dove: n= numero di elettroni trasferiti durante la reazione; Z= costante di Faraday

38 Misura del potenziale di riduzione standard (E’°) di una coppia redox

39 Coenzimi Redox La loro riduzione nei processi catabolici consente di conservare l’energia libera rilasciata dall’ossidazione dei substrati. NAD, NADP : solubili in acqua si spostano rapidamente da un enzima all’altro. FAD, FMN: solubili in acqua sono legati saldamente agli enzimi chiamati flavoproteine. Chinoni (ubichinone): solubili nei lipidi, operano nell’ambiente non acquoso della membrana come trasportatori di elettroni e donatori di protoni. Proteine ferro – zolfo e citocromi: contengono gruppi prostetici saldamente legati che possono ossidarsi o ridursi reversibilmente

40 NAD e NADP

41 NAD, NADP La parte reattiva di entrambi i coenzimi è l’anello benzenoico della nicotinammide che può subire una riduzione reversibile; Nell’ossidazione di un substrato questo perde due atomi di idrogeno, l’anello nicotinammidico accetta un protone (H+) e due elettroni, che equivalgono ad uno ione ioduro (:H-) e si trasforma nella forma ridotta; il secondo H+ rimosso dal substrato viene rilasciato nel solvente acquoso. La forme ridotte dei trasportatori sono NADH e NADPH, mentre le forme ossidate sono NAD+ e NADP+; il segno + non indica che ci sono cariche nette positive sulla molecola, ma piuttosto che l’anello nicotinamidico è nella sua forma ossidata, con una carica positiva sull’azoto. Il NAD+ è il principale accettore di elettroni nelle ossidazioni di molecole combustibili; il rapporto intracellulare NAD+/NADH è generalmente elevato. Il NADP+ è il principale cofattore nelle biosintesi riduttive; il rapporto intracellulare NADPH/NADP+ è generalmente elevato.

42 Struttura della niacina e dei suoi derivati nicotinammidici

43 I nucleotidi flavinici:
flavin mononucleotide (FMN) e flavin adenin dinucleotide (FAD) Altri trasportatori di elettroni implicati nelle ossidazioni dei substrati sono i nucleotidi flavinici, cofattori delle flavoproteine, flavin mononucleotide (FMN) e flavin adenin dinucleotide (FAD), le cui forme ridotte sono FMNH2 e FADH2. I nucleotidi flavinici sono legati piuttosto saldamente alle flavoproteine (anche covalentemente) e rappresentano dei gruppi prostetici con cui le flavoproteine possono temporaneamente trattenere equivalenti riducenti. L’associazione tra il gruppo prostetico e l’enzima conferisce all’anello flavinico un potenziale di riduzione standard diverso in ogni flavoproteina

44 Forme ossidate e ridotte del FAD e dell’FMN

45 Flavin adenin dinucleotide FAD
La parte reattiva del FAD è l’anello isoallossazinico che subisce riduzioni reversibili accettando uno o due elettroni sotto forma di atomi di idrogeno. Quando un nucleotide flavinico accetta un solo elettrone (un solo atomo di idrogeno), si genera la forma semichinonica dell’anello isoallosazinico (FADH e FMNH). Anche in questo caso i nucleotidi ridotti, ma non le forme ossidate, assorbono la luce ad una lunghezza d’onda di 360 nm; le forme parzialmente ridotte (un elettrone) hanno il massimo di assorbimento intorno a 450 nm, mentre la forma completamente ossidata (la flavina) assorbe tra 370 e 440 nm.