1° ESERCITAZIONE: lisi dei batteri

Presentazione sul tema: "1° ESERCITAZIONE: lisi dei batteri"— Transcript della presentazione:

1 1° ESERCITAZIONE: lisi dei batteri
Preparare il Buffer di lisi aggiungendo NaCl e Tris pH 8.0 alla soluzione fornita seguendo la tabella per le concentrazioni (Volume finale 1,5 ml) Concentrazione Iniziale Concentrazione Finale NaCl 5M 150mM Tris pH 8.0 1M 50mM Aggiungere freschi al Buffer di lisi il Cocktail di Inibitori delle Proteasi (250X) Risospendere il pellet batterico fornito con 1,5 ml di Buffer di lisi Aggiungere al pellet risospeso il Lisozima (250X) Incubare in ghiaccio per 20 minuti Congelare il lisato batterico Lisato batterico X Y J proteina Z GST

2 2° ESERCITAZIONE: preparazione della proteina di fusione
Protocollo 1 Scongelare il lisato batterico Prelevare 1 ml di lisato e aggiungerlo alla resina fornita Incubare 20 minuti in ghiaccio Centrifugare 4 minuti a 2500 rpm Eliminare il supernatante Effettuare 3 lavaggi con 1 ml di PBS1X, centrifugando 4 minuti a 2500 rpm Risospendere la resina in 300 μl di PBS1X Protocollo 2: calcolo della concentrazione della proteina di fusione Prelevare 1 μl di proteina di fusione e diluirlo in 1 ml di soluzione di Bradford Leggere allo spettrofotometro Calcolare la concentrazione della proteina proteina Resina GST

3 3° ESERCITAZIONE: controllo della proteina di fusione su gel
Protocollo Prelevare 2 μg di proteina Risospendere in Buffer di caricamento (3X) Caricare su gel di poliacrilammide Gruppi M 1 4 6 5 9 13 19 12 22 23 3 8 17 M 15 20 18 16 2 14 10 21 11 KDa 170 130 95 72 PTP 55 43 34 GST 26