ANALISI PROTEICA La forte affinità e specificità di legame tra antigeni ed anticorpi è sfruttata anche in tecniche di “blotting” di proteine per la rivelazione.

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1 ANALISI PROTEICA La forte affinità e specificità di legame tra antigeni ed anticorpi è sfruttata anche in tecniche di “blotting” di proteine per la rivelazione di proteine di interesse diagnostico e clinico. Western blots e dot blots sono le tecniche più comunemente usate.

2 ANALISI PROTEICA Western Blot analisi: Dot Blot analisi:
CL molecule product enzyme detection antibody protein (a) (b) second anti-species antibody unlabeled detection (c) biotin streptavidin Dot Blot analisi: La differenza con il western blot consiste nel fatto che le proteine non sono separate per via elettroforetica, ma sono depositate direttamente sulla membrana.

3 ANALISI GENICHE La ricerca di specifiche sequenze geniche ha una grande importanza in ambito clinico e diagnostico in quanto l’identificazione della sequenze genica associata ad un determinato effetto permette di individuarne le cause. L’isolamento e la quantificazione di sequenze di acidi nucleici e lo studio della loro organizzazione, localizzazione, ed espressione è reso possibile da: - marcatura di acidi nucleici per produrre DNA/RNA sonda - fenomenmo di autoduplicazione; ibridazione

4 DNA Struttura primaria del DNA: sequenza di basi nucleotidiche (adenina, guanina, citosina, timina) contenente l’informazione genetica, legate fra di loro attraverso i ponti della catena zucchero-fosfato. Struttura secondaria del DNA: doppia elica con uno scheletro idrofilo zucchero-fosfato e basi idrofobiche impacchettate perpendicolarmente all'asse dell'elica. I due filamenti di DNA complementari si sviluppano in direzione opposta.

5 DNA Stabilità del DNA: La doppia elica è stabilizzata dalla formazione di legami ad idrogeno tra le basi presenti sui filamenti opposti secondo lo schema A-T e G-C:

6 IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI
IN VIVO: alla base dei processi di riconoscimento molecolare IN VITRO: l’ibridazione di sequenze target con sonde oligonucleotidiche è l’approccio tipico per l’identificazione e l’isolamento di acidi nucleici Denaturazione del DNA target con trattamento termico per rompere i legami H Mix frammenti sonda + target per far avvenire l’appaiamento di sequenze complementari

7 IBRIDAZIONE DI ACIDI NUCLEICI

8 STABILITA’ DELL’IBRIDO
Temperatura di melting Tm Tm = temperatura alla quale il 50% del DNA (o ibrido) è presente in forma denaturata; cioè come singolo filemanto È un indice della stabilità del legame chimico La denaturazione del Dna provoca una variazione delle proprietà spettroscopiche

9 DK = e-G(complementare/non complementare)/RT
IBRIDAZIONE L’ENERGIA necessaria per separare due filamenti complementari di DNA dipende da: LUNGHEZZA dei filamenti (più sono lunghi più energia occorre) COMPOSIZIONE di basi azotate (la coppia GC possiede un legame idrogeno in più rispetto alla coppia AT, quindi filamenti ricchi in GC richiedono maggiore energia per esser separati) COMPLEMENTARIETA’ delle catene di DNA: catene non perfettamente complementari fra di loro (con una o più basi “mismatched”) si legano ugualmente, ma con energia minore. AMBIENTE CHIMICO (la presenza di cationi monovalenti quali Na+ stabilizza la doppia elica, i denaturanti quali urea e formamide la destabilizzano) DK = e-G(complementare/non complementare)/RT G(complementare/non complementare)~4 kcal/mol DK ~ 1/100-1/1000

10 REAZIONI D’IBRIDAZIONE
La reazione d’ibridazione procede con una cinetica del secondo ordine a due stadi. La sensibilità delle reazioni di ibridazione è molto elevata (costante di associazione delle sonde = 1015 /mole) La specificità delle reazioni di ibridazione è alta. La complementarietà tra la sequenza di basi della sonda e dell’acido nucleico bersaglio è necessaria. Per la rivelazione delle reazioni d’ibridazione occorre marcare il DNA sonda. I metodi di marcatura degli acidi nucleici prevedono l’incoroporazione di nucleotidi marcati nel DNA, mediante reazioni enzimatiche o durante il processo di sintesi.

11 SONDE GENICHE Una Sonda di DNA (RNA) è un frammento di DNA/RNA marcato che viene utilizzato per identificare sequenze specifiche di acidi nucleici Le sonde sono di diverse dimensioni: oligomeri (contenenti meno di 50 basi) o frammenti di alcune migliaia di nucleotidi. Può essere a singolo o a doppio filamento, anche se prima di esser usata viene convertita a singolo filamento

12 MARCATURA IN VITRO Marcatura di un filamento con DNA Polimerasi (nel corso della sintesi del DNA vengono incorporati nucleotidi marcati) • NICK TRANSLATION • RANDOM PRIMING Marcatura terminale (aggiunta di un gruppo marcato ad uno o più nucleotidi terminali) Marcatura di RNA

13 Nick Translation pApGpCpTpApCpGpTpTpAp… pTpCpGpApTpGpCpApApTp…
Dnasi I Introduzione di rotture a singolo filamento che lasciano esposte le estremità OH e i gruppi fosfato pApGpCpTpApCpGpTpTpAp… pTpCpGpApTpGpCpApApTp… P Pol OH Eso Dnasi I Pancreatica pApG CpTpApCpGpTpTpAp… pTpCpGpApTpGpCpApApTp… Esonucleasi 5’3’ Polimerasi 5’3’ + dATP, dCTP dGTP, dTTP La rottura esposta serve da punto di partenza per introdurre nuovi nucleotidi pApGpCpTpApCpGpTpTpAp… pTpCpGpApTpGpCpApApTp…

14 Random Priming Denaturazione e riappaiamento in presenza di una miscela random di esanucleotidi 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ Subunità di Klenow della DNA Polimerasi + dATP, dCTP, dGTP, dTTP 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’

15 Marcatura Terminale del DNA
5’ 3’ P 32 A P P P Polinucleotide chinasi A P P P 32 5’ P 3’ Il fosfato 5’ terminale dell’oligonucleotide viene sostituito dal 32P del gruppo fosfato dell’ATP

16 Tipo di emissione/Energia
MARCATURA ISOTOPICA Attraverso la marcatura diretta, Il marcatore è legato covalentemente direttamente all’acido nucleico, o intercala con legami non covalenti direttamente tra la doppia elica del DNA sonda. Le sonde radioattive, sonde “calde”, contengono nucleotidi in cui è inserito un radioisotopo (es. 32P, 35S, 3H) che viene individuato in soluzione o tramite autoradiografia Radioisotopo Emivita Tipo di emissione/Energia 3H 12.4 anni - / MeV 32P 14.3 giorni - / 1.71 MeV 35S 87.4 giorni - / MeV Le sonde “calde” sono le più sensibili.

17 MARCATURA NON ISOTOPICA
Le sonde non radioattive sono dette sonde “fredde”. La marcatura Non radioattiva può essere diretta o indiretta. I vari tipi di marcatori sono: Composti chemiluminescenti: luminolo e derivati Enzimi: fosfatasi alcalina, luciferasi batterica o da lucciola, HRP, … Inibitori enzimaticic: acido fosfonico Composti fluorescenti: fluorescina, rodamina, chelati di europio Fotoproteine: acquorina

18 MARCATURA NON ISOTOPICA
MARCATURA DIRETTA Per metodi basati sull’utilizzo di sonde più lunghe di 300 basi, la marcatura diretta con AP o HRP è consigliata, in questo modo la formazione dell’ibrido è rivelata semplicemente aggiungendo il substrato chemiluminescente per l’enzima. enzyme CL molecule product gene probe target sequence La marcatura enzimatica permette l’amplificazione del segnale, la luminescenza permette di sviluppare metodi sensibili per la rivelazione di quantità piccole di acidi nucleici.

19 MARCATURA NON ISOTOPICA
MARCATURA INDIRETTA Sebbena la marcatura diretta di sonde relativamente corte con enzimi sia stata presentata, la presenza di un enzima legato ad una sonda di piccole dimensioni può inficiare la cinetica e la specificità della reazione d’ibridazione. La marcatura con apteni permette sempre lo sviluppo di sistemi amplificati (es. biotina-avidina, biotina-streptavidina) Sonde geniche di piccole dimensioni sono spesso marcate indirettamente con apteni che sono poi immunorivelati attraverso anticorpi anti-aptene marcati con l’enzima anti-hapten antibody hapten

20 Marcatore della proteina
MARCATURA NON ISOTOPICA Mediante marcatura indiretta: una opportuna specie chimica (di solito un aptene) viene legata covalentemente alla sonda genica, ed al momento opportuno questa specie viene rivelata attraverso il suo legame con una adatta molecola di legame marcata con il tracciante. Aptene Proteina legante Marcatore della proteina Biotina Avidina Streptavidina (Kaff 10 14) Fosfatasi alcalina b-galattosidasi fluorescina HRP Digossigenina Antidigossigenina IgG Antispecie IgG Horseradish peroxidase Poly (dA) Poly (dT)

21 MARCATURA NON ISOTOPICA
Una scoperta relativamente recente che permette la rivelazione di specifiche sequenze geniche è rappresentata dai “molecular beacons”. Esse sono sonde oligonucleotidiche che rivelano la presenza di una specifica sequenza target (DNA o RNA) attraverso l’emissione di un intenso segnale fluorescente a seguito della reazione di ibridizzazione. I “molecular beacons” sono oligonucleotidi a filamento singolo con struttura “STEM-LOOP”,Alle estremità della porzione “STEM” sono legate rispettivamente una molecola fluorescente ed un “quencher”. sequenza target LOOP STEM fluoroforo “quencher”

22 METODI DI RIVELAZIONE Colorimetry. Colorimetric assays produce soluble colored products and are relatively insensitive compared to luminescent assays; simple visual read-out Fluorescence and time-resolved fluorescence. Capable of detecting single molecules of fluorescein; High background signal due to nonspecific fluorescence present in biological samples Since the background fluorescence tends to be short-lived, it can be avoided by using a short lived fluorophore, e.g. europium chelate Electrochemiluminescence. An electrochemical reaction produces excited-state species that decay to produce ground state product and light; need for specialized equipment that combines electrochemical-generation and light-detection capabilities

23 METODI DI RIVELAZIONE Chemiluminescence and Bioluminescence. Chemiluminescence is the emission of light that occurs in certain chemical reactions because of decay of electronic excited molecules to the ground state; bioluminescence is the chemiluminescence of nature (e.g. the firefly photinus pyralis) Both methods are very sensitive (zeptomole amounts, moles) rapid and versatile (adaptable for hybridization in solution and on membranes and monitoring with Charge Coupled Device cameras). Phosphorescence. Long-lived emission from triplet excited states (e.g. inorganic phosphor crystals); Irradiation with ultraviolet light results in a long-lived signal (milliseconds to microseconds); Signal acquisition using photographic film or a CCD camera

24 RIVELAZIONE DEI MARCATORI NON ISOTOPICI
Aequorin (apoaequorin produced by recombinant DNA techniques is converted to aequorin (the photoprotein present in the jellyfish Aequora) by reaction with coelenterazine and light emission from aequorin is triggered by calcium ions, light is emitted as a flash (469 nm) Alkaline Phosphatase Chemiluminescent: AMPPD (adamantyl 1,2-dioxetane aryl phosphate) is dephosphorylated to a phenoxide intermediate which decomposes to form adamantone and an exited-state aryl-ester, which emits light as a protracted glow Bioluminescent: firefly luciferin O-phosphate luciferin Colorimetric, time-resolved fluorescent AP

25 RIVELAZIONE DEI MARCATORI NON ISOTOPICI
Europium chelates: lanthanides, e.g. europium 3+ and terbium 3+ form highly fluorescent chelates with naphthoyltrifluoracetone. Long-lived fluorescence ( us) Fluorescein: (quantum yield bigger than 0.85) used in nonseparation energy transfer probe assays Glucose-6-phosphate dehydrogenase: used with marine bacterial luciferase NAD(P)H:FMN oxidoreducatse reaction Horseradish peroxidase: catalyzes the chemiluminescent oxidation of luminol and, in the presence of small amounts of phenols and amines the analytical features of this reaction are enhanced. The light emission from this reaction is a long-lived glow (>30 min)

26 RIVELAZIONE DEI MARCATORI NON ISOTOPICI
Luminol and Isoluminol: metal ions and peroxidases catalyze the chemiluminescent oxidation of luminol and isoluminol Phosphors. protein A can be labeled with red-emitting yttriumoxisulfide or green-emitting zinc silicate phosphors (southern and dot blots). Phosphorescence signal is not influenced by the presence of water, pH or changes in temperature Renilla Luciferase: catalyzes the bioluminescent oxidation of coelenterazione. Light is emitted as a glow Xanthine oxidase: catalyzes the luminescent oxidation of luminol. Long-lived light emission (lasting for several days) is enhanced by an iron-EDTA complex via hydroxyl radical production

27 TECNICHE DI IBRIDAZIONE
Le reazioni d’ibridazione sono reazioni bimolecolari fra una molecola “target” ed una molecola “sonda” in cui catene complementari di acidi nucleici si associano a formare molecole a doppia catena sulla base della complementarietà di sequenza. L’ibridazione può avvenire: - in soluzione - in fase mista (ibridazione su filtro) - in situ

28 Micropiastra streptavidinata
IBRIDAZIONE IN SOLUZIONE Questo tipo di reazione d’ibridazione è il più efficace:il bersaglio denaturato e la sonda marcata vengono miscelati in soluzione. I tempi d’ibridazione sono accelerati. L’inconveniente è quello di dover separare l’ibrido formato dalla sonda che non ha reagito. Sono state ideate tecniche che prevedono la cattura dell’ibrido formatosi in soluzione su un supporto solido; generalmente la sonda contiene un ligando, tipo biotina che permette la cattura su un supporto solido. Es: PCR-ELISA Sonda biotinilata + Micropiastra streptavidinata

29 IBRIDAZIONE IN SOLUZIONE
La PCR-ELISA permette la rivelazione degli ibridi formati in soluzione grazie alla cattura su micropiastre. hapten Il metodo PCR-ELISA prevede che: Il DNA bersaglio viene marcato con un aptene appropriato tramite tecnica PCR. Quindi l’ibridazione con un DNA sonda marcato con biotina avviene in soluzione, quindi l’ibrido è catturato su piastre ricoperte di streptavidina. Quindi gli ibridi sono rivelati attraverso l’uso di un anticorpo anti-aptene coniugato con un enzima e l’aggiunta del substrato opportuno. target DNA PCR anti-hapten antibody

30 IBRIDAZIONE SU FILTRO I filtri utilizzati possono essere di materiale diverso. Tra i più usati ci sono: Nitrocellulosa -Nylon -Nylon carico positivamente L’ibridazione su filtro prevede 5 passaggi: 1)fissaggio dell’acido nucleico denaturato su filtro; 2)preibridazione per bloccare i siti sulla membrana; 3)ibridazione, si fa incubare la membrana con la sonda marcata; 4)lavaggi, per rimuovere l’eccesso di sonda; 5)rivelazione dell’ibrido in base al tipo di sonda marcata usata. Le principali tecniche d’ibridazione su filtro sono: - “southern Blotting” - “Dot-Blot” - “Reverse dot-blot”

31 IBRIDAZIONE SU FILTRO Per un’analisi di Southern Blotting:
Il DNA è isolato da cellule o tessuti e diviso in fgrammenti di diverse dimensioni con enzimi che tagliano il DNA a siti spoecifici. I vari frammenti sono separati in base alla dimensioni mediante elettroforesi su gel. I frammenti sono poi denaturati per ottenere I singoli filamenti che devono reagire con le sonde complementari. I singoli frammenti sono trasferiti su una membrana di nitrocellulosa e analizzati per ibridazione con una sonda marcata La sonda che non ha reagito è eliminata tramite lavaggi RNA – Northern Blotting Protein – Western Blotting

32 IBRIDAZIONE SU FILTRO

33 IBRIDAZIONE SU FILTRO La tecnica Dot-Blot è simile alla Southern Blot in termini di utilizzo di una sonda genica marcata. La differenza consiste nel fatto che i differenti campioni di acidi nucleici (DNA o RNA) non vengonoi separati per via elettroforetica ma sono depositati direttamente su filtro per poi essere ibridati con una sonda marcata. La tecnica Reverse-Blot è una modifica della Dot-Blot tradizionale: sul filtro, infatti, viene fissata la sonda non marcata che viene fatta ibridare con una soluzione d’ibridazione contenente il bersaglio precedentemente marcato.

34 IBRIDAZIONE SU FILTRO La tecnica Reverse Dot Blot sfrutta una sonda non marcata immobilizzata su una membrana. Il DNA bersaglio è prodotto in modo tale da essere marcato con uno specifico aptene (es biotina). Quindi viene ibridato con la sonda immobilizzata e rivelato con un enzima coniugato con streptavidina e un substrato, ad esempio CL, appropriato. biotin target DNA PCR CL molecule product enzyme streptavidin immobilized gene probe

35 IBRIDAZIONE IN SITU Nella tecnica di ibridazione in situ, il campione è rappresentato da un tessuto o da cellule coltivate in vitro. Questi si mettono a contatto con la sonda: si procede alla denaturazione contemporanea del DNA contenuto nel tessuto e Quello della sonda e poi si lascia avvenire l’ibridazione. DNA di Papillomavirus identificato mediante una sonda genica marcata con un tracciante fluorescente DNA rivelato mediante un intercalante fluorescente Struttura cellulare rivelata mediante un anticorpo anti-citocheratina marcato con un tracciante fluorescente