BIOSENSORE : definizione

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1 BIOSENSORE : definizione
TRASDUTTORE ELEMENTO BIOLOGICO ANALITA TARGET SEGNALE MISURABILE Membrana selettiva

2 Requisiti di un biosensore
1. Relevance of output signal to measurement environment 2. Selectivity and repeatability 3. Sensitivity and resolution 4. Dynamic range 5. Speed of response 6. Insensitive to temperature (or temperature compensation) 7. Insensitive to electrical and other environmental interference 8. Amenable to testing and calibration 9. Reliability and Self-Checking Capability 10. Physical robustness 11. Service requirements and price 12. Life time and Reusability

3 According to a recently proposed (1999) IUPAC definition:
“A biosensor is a self-contained integrated device which is capable of providing specific quantitative or semi-quantitative analytical information using a biological recognition element which is in direct spatial contact with a transducer element. A biosensor should be clearly distinguished from a bioanalytical system, which requires additional processing steps, such as reagent addition. Furthermore, a biosensor should be distinguished from a bioprobe which is either disposable after one measurement, i.e. single use, or unable to continuously monitor the analyte concentration”.

4 Elemento biologico di riconoscimento molecolare
Enzimi (biosensore catalitico) transformazione dell’analita in un prodotto misurabile inibizione dell’ enzima da parte dell’ analita -modifiche dell’enzima indotte dall’analita Antigene-anticorpo -legame ad alta affinità con un tracciante che produce il segnale o direttamente reazione Ab-Ag senza tracciante DNA: -reazioni di ibridazione ad alta affinità Sensori Biomimetici - molecole ad alta affinità (singole catene di anticorpi,..) - polimeri imprintati Biosensori cellulari inibizione della vitalità cellulare(respirazione,.. -proteine di transporto di membrana -neurorecettori (producono il signale attraverso i canali ionici -cellule (batteri, lieviti,..) geneticamente modificati per esprimere l’elemento di riconoscimento molecolare (recettore, proteina di legame,..)e un gene reporter per la trasduzione in un segnale misurabile (luc, lux, GFP,..)

5 BIOSENSORE : Trasduzione
Il segnale che viene prodotto dalla interazione dell’ analita con l’ elemento biologico può essere: Potenziometrico modifiche nella distribuzione delle cariche che produce un potenziale elettrico Amperometrico movimento di elettroni in una reazione redox Calorimetrico produzione o assorbimento di calore dal processo chimico Ottico assorbimento, emissione, rifrazione, “scattering” ..della luce nella reazione Piezoelettrico variazioni di massa dovuti al legame dell’analita Foto-acustico,..……

6 Principio dei biosensori
RECOGNITION LAYER TRANSDUCER Analyte Electro-active substance pH Changes Heat Light Mass changes Electrode pH electrode Semiconductor Thermistor Photon counter Piezoelectric Dv Enzyme Antibody Micro- Organism Cell Electric signal

7 Per Riassumere:

8 Cenni storici del Biosensori
Concetto e principio -- Leland Clark (1956) Sensore per l’ urea -- Guibault & Montalvo (1969) Glucosio - Yellow Springs Instr. Co. (1973) Termistore enzimatico – Mosbach (1974) Electrodo a microorganismi – Divis (1975) Sensore per l’ Ossigeno a fibra-ottica – Lubbers & Opitz (1975) Immnosensore – Liedberg et al. (1982) Elettrodo enzimatico – MediSense Inc. (1987) BIAcore – Pharmacia, Sweden (1990) Nanosensore – Vo-Dinh (2000) This is an optically-based  biosensor (specifically a technique called surface plasmon resonance) which is sold  into the bioscience R & D laboratory market for the real time analysis of biological  interactions.  

9 Potenziali campi di applicazione
farmaci, residui,tossine,.. negli alimenti microinquinanti nell’acqua e nell’aria monitorare un processo biologico virus, bacteria,.. ions composti organici analiti di interesse chimico-clinico e diagnostico …………… Sistemi complementari ai sistemi analitici tradizionali con l’obiettivo principale di ottenere una risposta rapida o in tempo reale

10 Biosensori Elettrochimici
Potenziometrici : Viene misurato il potenziale di una cella a valore di corrente zero. Amperometrici : Si misura l’Intensità di corrente dovuto ad un processo Ox-red.

11 Biosensori potenziometrici
Elettrodo di riferimento Risultato: Differenza di potenziale Processore di segnale I corrente = 0 Elettrodo indicatore

12 (elettrodo indicatore)
Elettrodi ionoselettivi ISE ISE (elettrodo indicatore) Elettrodo di riferimento (esterno) Membrana [ai]campione V Ecell = Eind – Eref + Elj semplificata: Ecell = K + Eind Equazione di Nernst Ecell = K RT log [ai]campione zF Curva Standard Ecell Dove: E = Potenziale elettrochimico K = costante R = Costante dei gas (8.314 joules/(mole)(°K)) T = Temp. assoluta Z = Numero di elettroni trasferiti F = Costante di Faraday (96,487 coulombs/mole di elettroni) ai = Attività della specie ionica (ai = Cifi; dove C è la concentrazione dello ione ed f ilcoefficiente di attività . log [ai]campione

13 Esempi di elettrodi ionoselettivi
Elettrodo a vetro Variazione di carica dovuta al legame di H+ alla membrana Risultato: variazione di potenziale ISFET Elettrodo per il Sodio

14 Elettrodo per il Potassio
Esempi di elettrodi ionoselettivi Elettrodo per il Potassio Elettrodo per la CO2 Valinomicina

15 Elettrodi ISE Miniaturizzati
La superficie dell’elettrodo è costituita da un film di Ag/AgCl serigrafato e da un film che permette un traferimento efficiente di energia tra la membrana di PVC , la superficie di AgCl e la membrana ionoselettiva. L’elettrodo di riferimento è costituito da un film di Ag/AgCl. Che deve essere in contatto con una soluzione a concentrazione nota di ioni Cl- per funzionare.

16 Esempio di biosensore potenziometrico
(a) Membrana semi-permeabile (b) Biocatalizzatore (c) Membrana di vetro (d) Probe per il pH (e) Potenziale elettrico generato (f) Elettrodo interno Ag/AgCl (g) HCl diluto (h) elettrodo esterno di riferimento

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18 Vantaggi e svantaggi dei Biosensori Potenziometrici
Disponibilità di un elevato numero di enzimi utilizzabili. Elevata tecnologia disponibile e conoscenze scientifiche Facile installazione, misure semplici e dirette . Diverse configurazioni ( Statica, a flusso , micro ). Facile automazione e applicabilità Bassi costi. Svantaggi Scarsa selettività di alcuni biosensori. Il numero di biosensori disponibili è molto limitato

19 MOSFET variazione del potenziale applicato variazione di intensità
di corrente Modulazione di I dal potenziale applicato

20 Transistor per misure di pH
Elettrodo di riferimento Membrana Sensibile a H+ Membrana biocatalitica Membrana Iono selettiva silicio 500 m Il corpo principale è costituito da un chip di silicio con due aree +/- tipo-n. Il chip è isolato da un film di 0.1 m di SiO2 che forma la piattaforma del FET. Sopra vi è un film di materiale sensibile agli H+, la membrana ione selettiva, la membrana biocatalitica e quindi la soluzione contenente l’analita che è separata dalla parte sensibile del FET da un polimero inerte. Quando si applica un potenziale ai due elettrodi si avrà un passaggio di corrente attraverso il FET funzione del potenziale positivo rivelato al polo dello ione positivo. Questa corrente (I) viene confrontata con quella ottenuta con un ISFET non catalitico immerso nella stessa soluzione

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23 Immagini di alcuni Biosensori ISFET

24 Differenza di potenziale
Biosensori amperometrici Elettrodo di riferimento Risultato: Intensità di corrente Processore di segnale Differenza di potenziale prefissata Elettrodo di lavoro

25 introduzione elettrolita Membrana permeabile all’O2
Elettrodo ad Ossigeno Il biosensore amperometrico più semplice utilizza l’elettrodo ad ossigeno di Clark. Questo è costituito da un catodo di Pt al quale l’O2 si riduce ed un elettrodo di riferimento Ag/AgCl. . Ag anodo     4Ag0 + 4Cl AgCl + 4e-   Pt catodo     O2 + 4H+ + 4e H2O  Collegamento amplificatore introduzione elettrolita KCl 100 mM Filo di Ag ricoperto con AgCl Tubo di plexiglas Filo di Pt forgiato per essere sigillato da vetro ed avere una superficie piatta esposta all’analita Membrana permeabile all’O2

26 elettrodo pO2 L’elettrodo pO2 consiste di un catodo di platino e di un elettrode di riferimento Ag/AgCl.

27 Biosensori amperometrici di I generazione
I biosensori amperometrici di prima generazione monitorano il consumo di O2 o la produzione di H2O2 associate all’ossidazione di un substrato da parte di un enzima ossidasi

28 Biosensore amperometrico per il glucosio
La glucosio ossidasi catalizza la seguente reazione in due passaggi: Glucosio + FAD + H2O ———> Acido gluconico +FADH2 FADH2 + O2 ———> H2O2 + FAD La glucosio ossidasi è immobilizzata sulla membrana a gas del sensore così l’elettrodo di lavoro compete con l’enzima per l’ossigeno molecolare. glucosio Membrana permeabile all’O2 .

29 Biosensore amperometrico per il glucosio
Misure batch Misure in flusso Tipica risposta del biosensore amperometrico per il glucosio

30 Misure FIA (flow injectio analysis)
Biosensore amperometrico per il glucosio Misure FIA (flow injectio analysis)

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33 Biosensore ad acqua ossigenata
La stessa reazione catalizzata dalla glucosio ossidasi può essere utilizzata per monitorare la produzione di acqua ossigenata. L’acqua ossigenata è ossidata all’elettrodo di lavoro secondo la seguente reazione: H2O2 —-——> O2 + 2H+ + 2e- L’enzima è immobilizzato e tenuto il più vicino possibile l’elettrodo di lavoro. E’ prodotta una corrente proporzionale alla concentrazione del metabolita da analizzare. Un fattore limitante di questi sensori è che sono dipendenti dalla solubilità dell’ossigeno nelle soluzioni campione.

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35 Biosensori amperometrici di II generazione
Si utilizzano dei “mediatori” che trasferiscono gli elettroni direttamente all’elettrodo bypassando la riduzione dell’ossigeno. I ferroceni rappresentano il gruppo di mediatori più utilizzati .

36 Biosensori amperometrici di III generazione

37 Biosensori Amperometrici
Vantaggi Non influenzato dal drift dell’elettrodo di riferimento Risposta lineare. Sono più sensibili di quelli potenziometrici. E’ possibile miniaturizzarli Svantaggi La corrente amperometrica consuma l’analita e la sua diffusione influenza la risposta. La misura amperometrica viene eseguita ad un particolare potenziale di lavoro dove altre sostanze potrebbero reagire ed interferire. Il materiale all’anodo si consuma riducendone il tempo di utilizzo, paricolarmente quando si utilizzano film sottili di Ag/AgCl .

38 Sensori Piezoelectrici
Sistemi piezoelettrici Cristallo di quarzo Elettrodo d’oro Microbilancia al quarzo QCM

39 Microbilancia al quarzo (QCM)
Modifiche nell’intorno del cristallo

40 Biosensori Piezoelettrici
Transduttore: microbilancia cristallo di quarzo (QCM) probe immobilizato DNA Target, Ag, Ligando Si forma un duplex, Ab-Ab, Complesso lig-recettore la massa aumenta Cala la frequenza di risonanza del cristallo

41 Biosensori Piezoelettrici
La relazione tra massa m e frequenza f è data dalla nota relazione di Sauderbery: Dove: -Δf è la variazione di frequenza (Hz), -Δm è la variazione di massa della sostanza assorbita sulla superficie (g), - K è una costante che dipente dalla densità e dal tipo di cristallo (taglio), -A è la superficie (cm2) Cristallo di quarzo Oscillatore 10MHz Analita in soluzione

42 Biosensori Piezoelettrici elemento biospecifico
Sensitive coating elemento biospecifico immobilizzato

43 immobilizzato sulla bilancia QCM
Anticorpo anti-gD IgG immobilizzato sulla bilancia QCM

44 The amount of protein deposited on the films increases with time.
The protein deposition appears to reach a plateau which represents maximum absorption onto the film.

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48 Tecniche di immobilizzazione
1)Immobilizzazione fisica: operativamente semplice ma meno stabile. 2)Immobilizzazione chimica: operativamente complessa, ma più stabile Schema di reticolazione con BSA-gluteraldeide Schema di reticolazione su membrane carbossiliche con carbodimmide

49 Sviluppo di immunosensori
Immobilizzazione di una proteina Sviluppo di immunosensori L’obiettivo è quello di minimizzare interazioni aspecifiche e quindi sviluppare un immunosensore specifico e con il vantaggio di non utilizzare un tracciante e quindi misurare direttamente l’interazione Ab—Ag Si può utilizzare per esempio: sistema avidin-biotin, thiol-dextran, DSP, silanizzazione e assorbimento.

50 Biosensore Ottico Risultato Riconoscimento molecolare
Processore Ligando Immobilizzato Superficie del sensore Rivelatore Ottico Risultato Segnale Elettrico

51 Biosensore Ottico: Principi

52 Biosensore Ottico: Principi

53 Biosensore a fluorescenza
Es: biosensori basati su esteri del boro

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56 Biosensore a fluorescenza
DETERMINAZIONE DI SUBSTRATI ENZIMATICI

57 Indirect Optical Immunosensors : FCFD
Fluorescence Capillary Fill Device

58 Biosensore a fluorescenza Fiber-optic cholesterol sensor

59 Y Y Y Y Capture antibody Sample applied, antigen
binds to capture antibody Y Other cells and debris washed away Y Laser on (( )) Detection antibody binds to antigen and fluoresces when laser turned on.

60 Evanescent Wave Technology
Laser (635 nm) Evanescent wave 100 nm Waveguide Cy5 Excited Cy5 >650 nm signal recovered In pAmps Waveguide

61 Sistema ottico per misure intracellulari
T. Vo-Dingh et al., Sensors and Actuators B, 2001

62 Sistemi ottici basati di misura della luce evanescente

63 Biosensori a risonanza di superficie plasmonica (SPR)
SPR, fenomeno che avviene quando la luce è riflessa da un film sottile di un metallo

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65 Prism Coupler-Based SPR Sensors
I. Wavelength modulation II. Angular modulation

66 Biosensori a SPR: applicazioni

67 The Resonant Mirror Cuvette
Vibro-stirrer in each well Sample Well Coupling Layer Resonant Mirror Prism Laser Low R.I. Layer Resonated hn Time Intensity of Resonated Light Detector Polariser f (arc sec)

68 Biosensore ottico ad onda evanescente
n1 > n2

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70 Substrati analizzabili con biosensori enzimatici

71 Biosensore calorimetrico
ΔΤ= Q/Cs=-n ΔΗ/M Cs Q = –(n/M)/ΔΗ

72 Biosensore calorimetrico

73 Biosensori a DNA DNA a doppia elica Elettrodo di lavoro

74 Tipi di biosensori a DNA

75 Biosensori piezolelettrici a DNA
Quartz crystal microbalance (QCM) transducers Immobilized DNA probe Target DNA Form duplex---mass increase Decrease in crystal’s resonance frequency

76 Immobilizzazione del DNA sulla QCM
Immobilizzazione di DNA-biotina su di un elettrodo QCM modificato

77 Immobilizzazione del DNA sulla QCM
Il DNA probe viene immobilizzato su di un cristallo piezoelettrico di quarzo ricoperto di streptavidina. La Streptavidina viene legata covalentemente ad uno strato monolayer costituito da 11-mercaptoundecanolo. Immobilizzazione del DNA sulla QCM Attivazione con EDC e NHS Probe: oligonucleotide biotinilato (Strept)avidina Biotina (Strept)avidina Strept)avidina Frequenza Hz Probe biotinilato Destrano 11-mercaptoundecanolo Tempo (sec) Oro

78 Biosensori Cellulari: potenziale d’azione
Potenziale di azione dato dalla differenza di concentrazione di specie ioniche attraverso la membrana cellulare

79 Biosensori Cellulari: potenziale d’azione
Misura del potenziale d’azione con un elettrodo

80 Biosensori Cellulari: potenziale d’azione
Valutazione della sensibilità ad un agente tossico

81 Biosensori Cellulari: biosensori respirometrici
Misura della variazione di O2 con elettrodo di Clark Respirazione di cellule

82 Biosensori Cellulari: biosensori respirometrici

83 Biosensori Cellulari Analyte Biosensor Signal Receptor LUCIFERASE
Responsive Element LUCIFERASE

84 Biosensori bioluminescenti
The Firefly Process: Oxyluciferin, AMP+Ppi, Light (560 nm) Luciferin, ATP, O2 Catalyst: Luciferase The Bacterial Process: Decanal FMNH2 O2 Decanoic acid, FMN*, H2O, Light, (490 nm) Catalyst: Luciferase

85 Biosensori bioluminescenti
Light output is directly proportional to the metabolic activity of a cell Light Output Increasing Toxicity Bioluminescence decreases in direct proportion to the level of toxicity present

86 Biosensori bioluminescenti
Normal levels of FMNH2 due to Active Respiration Bioluminescent cells Active Cell Reduced levels of FMNH2 due to Reduced Respiration Bioluminescence Reduced or stopped Damaged Cell following exposure to toxin

87 Multidisciplinarietà dei biosensori

88 Elemeno di bioriconoscimento
Biosensori futuri Elemeno di bioriconoscimento

89 Ultime pubblicazioni sui biosensori

90 World Biosensor Market

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