PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer.

Presentazione sul tema: "PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer."— Transcript della presentazione:

1 PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer

2 PCR da DNA genomico

3 PCR da mRNA (RT-PCR)

4 Uso dei “linkers”

5 Vettori dA:dT 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’

6 PCR da DNA genomico EcoRI BamHI BamHI EcoRI

7 Proteine di fusione prom Tag o rep. cDNA term trascrizione traduzione

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9 Elettroforesi di acidi nucleici
Gel di agarosio Gel di acrilammide

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12 Elettroforesi su gel di agarosio

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14 Tamponi di elettroforesi

15 Soluzioni di caricamento

16 Soluzioni di caricamento
Aumentano la densità del campione Colorano il campione Rendono visibile la corsa elettroforetica

17 Migrazione del DNA su gel

18 Fattori che influenzano la migrazione
Peso molecolare Concentrazione di agarosio Conformazione DNA Voltaggio applicato Intercalanti Tampone di elettroforesi

19 Visualizzazione del DNA

20 Marcatori di peso molecolare
 HindIII

21 Fotodocumentazione

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23 Recupero DNA da gel Elettroeluizione Agarosio “low melting”
Solubilizzazione agarosio

24 Gel di acrilammide

25 Apparato per gel di acrilammide

26 Metodi di sequenziamento
Sanger (enzimatico) Maxam e Gilbert (chimico)

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29 Metodo di Sanger primer quattro dNTP (incluso 32PdNTP) DNA polimerasi
ddTTP ddCTP ddGTP ddATP primer nuovo DNA dideossinucleotide terminatore La catena neosintetizzata termina quando un ddNTP è incorporato al posto di un dNTP Denaturare e separare su gel di poliacrilammide

30 Metodo di Maxam e Gilbert
DNA singolo filamento marcato ad una estremità 32P 4 o 5 reazioni di modificazione base-specifiche Es. metilazione delle G con dimetilsolfato Rottura del filamento in corrispondenza della base modificata mediante piperidina Separare i frammenti marcati su gel di acrilammide

31 Gel di poliacrilammide di sequenza

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33 Fasi di un progetto di sequenziamento
clonaggio e preparazione del DNA reazioni di sequenza elettroforesi su gel di poliacrilammide interpretazione e raccolta dati

34 Vettori a singolo filamento

35 Fagemidi

36 Strategie di sequenziamento
Primer specifici consecutivi Delezioni progressive Frammenti casuali (shotgun)

37 Reazioni base-specifiche

38 Confronto metodi di sequenziamento
Sanger rapida e semplice attuazione disponibilità di kit necessità di primer sensibile a strutture secondarie Maxam e Gilbert lunga preparazione del DNA reazioni da mettere a punto relativamente economico strutture non influenti utilizzabile per oligonucleotidi

39 Sequenziamento automatico

40 Sequenziamento con Taq polimerasi