Reazioni non elementari: Bioreazioni e bioreattori

Presentazione sul tema: "Reazioni non elementari: Bioreazioni e bioreattori"— Transcript della presentazione:

1 Reazioni non elementari: Bioreazioni e bioreattori
Reazioni enzimatiche Reazioni con microorganismi Bioreattori

2 Reazioni enzimatiche catalitiche
Un enzima, E, è una proteina o una sostanza simile ad una proteina con proprietà catalitiche. Un substrato, S, è la sostanza che viene chimicamente trasformata ad una velocità accelerata dovuta alla presenza dell’enzima. Un enzima può catalizzare SOLO una reazione. Reazioni non volute sono facilmente controllate. Enzimi sono prodotti principalmente da organismi viventi (batteri, per esempio). Enzimi solitamente funzionano in condizioni blande (pH 4~9, 25~ 70 C).

3 Enzimi La maggioranza degli enzimi prendono il nome dalla reazione che catalizzano (***asi), ad esempio: ureasi: l’enzima che catalizza la decomposizione dell’urea atpasi: l’enzima che trasforma ATP in ADP Fosfatasi : enzimi che trasferiscono un gruppo fosfato …. Tre tipi di reazioni enzimatiche: Enzima solubile – substrato insolubile (e.g. detergenti lavanderia) Enzima insolubile – substrato solubile (simile al PBR con catalizzatore) Enzima solubile – substrato solubile(e.g. molte reazioni bio) Due meccanismi principali di interazione substrato – enzima Lock and key model Induced fit model

4 Classificazione degli enzimi
1. OSSIDOREDUTTASI Nome sistematico: donatore : accettore ossidoreduttasi Reazioni di ossidoriduzione Nome comune: deidrogenasi o reduttasi 2. TRANSFERASI Nome sistematico: donatore : accettore gruppo transferasi Trasferimento di gruppi funzionali Nomenclatura corrente: Transaminasi (ma meglio, Amminotransferasi) Cinasi (fosfotransferasi) 3. IDROLASI Nome sistematico: substrato idrolasi Idrolisi: Rottura di un legame con intervento H2O Nome comune: substrato + suffiso asi 4. LIASI Nome sistematico: substrato : gruppo-liasi Rottura non idrolitica di un legame C-C, C-O, C-N o altro oppure addizione ad un doppio legame Schema comune di reazione: un substrato = due prodotti (o viceversa) Uno dei prodotti contiene un doppio legame (neoformato o preesistente) Nomenclatura comune: Rottura legame C-C: decarbossilasi (o carbossilasi) o aldolasi Rottura legame C-O: Idro-liasi 5. ISOMERASI Nome sistematico: in generale isomerasi Equilibrio fra isomeri Nome comune simile al sistematico, ma semplificato. 6. LIGASI Nome sistematico: X : Y ligasi (prodotto idrolisi) X e Y = nome molecole da unire; eventualmente, Fomazione di un legame accoppiata con idrolisi ATP o altro nucleotide Nome comune: Ligasi In alcuni casi si usa Sintasi o Carbossilasi.

5 Reazioni catalizzate da enzimi: esempio
Il meccanismo proposto per l’azione catalitica dell’ ureasi che permette la Decomposizione dell’urea in ammoniaca e anidride carbonica: (Levine e LaCourse, 1967) 1. L’enzima ureasi reagisce col substrato urea per formare un complesso enzima-substrato, E•S: S E E•S 2. Il complesso si decompone (indietro) in urea e ureasi: 3. Oppure può reagire con acqua per dare ammoniaca, anidride carbonica e ureasi: P W

6 A B C D E Velocità di sparizione del substrato:
Velocità netta di formazione del complesso E•S: B L’enzima non è consumato nella reazione: PSSH C D E

7 A k’3 Poiché la reazione viene condotto in soluzione acquosa: (W) ~ costante Vmax Questa è la forma della “Equazione di Michaelis-Menten” E Km è detta la costante di Michaelis B -rS A bassa concentrazione di substrato: (S) << Km Vmax B’ Vmax/2 Ad alta concentrazione di substrato: (S) >> Km B’’ Km (S) Caso speciale in cui Km è uguale alla concentrazione del substrato alla quale la velocità di reazione è uguale alla metà della velocità massima

8 Equazione di Michaelis-Menten
Vmax e Km caratterizzano la reazione enzimatica descritta dalla cinetica di Michaelis-Menten. Vmax dipende dalla concentrazione totale dell’enzima. Km è indipendente dalla concentrazione totale dell’enzima.

9 Esempio: cinetica di Michaelis-Menten
Urea che si decompone in ammoniaca e CO2 A 1/-rs B Pendenza= 0.02 = Lineweaver-Burk plot Intercetta = 0.75 = (1/S) (i.e. 1/Curea)

10 Esempio: cinetica di Michaelis-Menten
Oppure: Eadie – Hofstee plot Oppure Hanes – Woolf plot Oppure regressione diretta non lineare di per ottenere Vmax e Km Polymath model: rate = Vmax*Curea/(Km+Curea) Risultato: Vmax = 1.2 mol/dm3 s e Km = mol/dm3 A B

11 Reattore batch per reazione enzimatica
Progetto di un rene artificiale Reattore batch in fase liquida a volume costante (dN/dt=-rV): A Intercetta= B Pendenza= c d

12 Esempio: reattore batch
Calcolare il tempo necessario per convertire 99% di urea in ammoniaca e CO2 in un reattore batch da 0.5 dm3. Concentrazione iniziale di urea 0.1 mol/dm3 e concentrazione ureasi di g/dm3. Reazione isoterma alla T dell’esercizio precedente. Vale la eq: Conc E = (contro 5 caso precedente)  Vmax=0.001/5*1.33 = mol/s/dm3 Km = mol/dm3 t = s = 840 s = 14 min

13 Effetto della temperatura sulle reazioni enzimatiche
Molto complesso Se l’enzima restasse immutato, l’effetto sarebbe un effetto Arrenhius All’aumentare della T l’enzima si richiude e denatura Perdita capacità catalitica Due tendenze opposte Quindi all’aumentare di T –rS sale raggiunge un massimo e poi scende La parte discendente è chiamata de attivazione termica o denaturazione termica Vmaz -rs T

14 Inibizione di reazioni enzimatiche
La velocità di una reazione catalizzata da enzimi è influenzata da pH e dalla presenza di inibitori. Tre sono i più comuni tipi di inibizione reversibile: Competitiva Il substrato e l’inibitore sono molecole simili che competono per lo stesso sito sull’enzima. Acompetitiva L’inibitore deattiva il complesso enzima-substrato, normalmente attaccando se stesso oppure sia il substrato che le molecola dell’enzima nel complesso Non competitiva Per enzimi che contengono almeno due tipi diversi di siti. L’inibitore attacca solo un tipo di sito ed il substrato solo l’altro.

15 Bioreattori Bioreattore è un reattore che produce cellule e culture tissutali Tutte le reazioni cellulari sono catalizzate da enzimi Microorganismi e cellule mammarie sono usate per produrre una varietà di prodotti, come insulina, molti antibiotici, e polimeri. Vantaggi: Condizioni di reazione blande Alte rese Catalizzano passi successivi in una reazione per organismi con molti enzimi Sono catalizzatori stereospecifiche (si può formare un singolo isomero desiderato)

16 Bioreattori In generale, la crescita di un organismo in condizioni aerobiche segue: La velocità di questa reazione è proporzionale alla concentrazione di cellule e la reazione è auto catalitica.

17 Crescita delle cellule
tempo Log conc. cellule Crescita delle cellule 2 3 Sono identificate 4 fasi durante la crescita delle cellule in un batch (1) Lag phase Scarso aumento della concentrazione delle cellule Sintesi e trasporto delle proteine per muovere il substrato nella cellula Sintesi dell’enzima per utilizzare il nuovo substrato Inizio del lavoro di replicazione del materiale genetico cellulare (2) Exponential growth phase La velocità di crescita delle cellule è proporzionale alla loro concentrazione Le cellule utilizzano il nutriente efficientemente (3) Stationary phase Le cellule raggiungono il minimo spazio biologico dove la mancanza di uno o più nutrienti limita la crescita cellulare. Molti importanti prodotti di fermentazione, inclusi antibiotici, sono prodotti nella fase stazionaria (4) Dead phase Risultato della formazione di un sotto prodotto tossico e/o la interruzione della fornitura di nutriente 1 4

18 Velocità di reazione in bioreattori
L’espressione più comunemente usata per la crescita esponenziale è l’equazione di Monod : Concentrazione delle cellule Velocità di crescita delle cellule Concentrazione substrato Velocità di crescita specifica= Per crescita di E. coli su glucosio: mmax= 1.3 h-1 e Ks= mol/dm3 Velocità massima della reazione specifica di crescita Costante di Monod

19 Altre velocità di crescita:
Tenendo conto dell’inibizione (modello) Equazione di Monod Dove Cp* = concentrazione del prodotto alla quale tutto il metabolismo si ferma e n = costante sperimentale Altre velocità di crescita: Equazione di Tessier A Equazione di Moser B La velocità di morte delle cellule è: C Costante di velocità di morte tossica specifica Costante di velocità di morte naturale specifica Concentrazione di un substrato tossico per la cellule

20 Effetto della temperatura
Simile all’effetto sulle reazioni enzimatiche Effetto Arrenhius a basse T All’aumentare della T l’enzima si richiude e denatura Perdita capacità catalitica Due tendenze opposte I’ T A B

21 Stechiometria della crescita cellulare
Molto complessa… varia con il sistema microorganismo / nutriente; condizioni ambientali; Ancora più complessa se più nutrienti contribuiscono alla crescita delle cellule. Si può semplificare (un solo nutriente) in: Dove Yc/s è il coefficiente di resa: Dove Yp/s è il coefficiente di prodotto:

22 Stechiometria della crescita cellulare
Produce nuove cellule Consumo del substrato Mantiene le attività delle cellule Valore tipico = 0.05 h-1 Quindi, la velocità di consumo del substrato per manutenzione: A Il coefficiente di resa, Y’c/s , tiene conto del consumo del substrato per manutenzione:

23 Stechiometria della crescita cellulare
Durante la fase di crescita A Formazione prodotto Durante la fase stazionaria B La velocità netta di consumo del substrato: C Velocità di consumo per manutenzione Velocità di consumo per formazione di prodotto Velocità di consumo per crescita delle cellule

24 Stechiometria della crescita cellulare
B Se il prodotto è formato durante la fase di crescita C E Se il prodotto è formato durante la fase stazionaria D Dove Csn è la concentrazione del nutriente secondario Simile alla eq. Di Monod

25 Bilancio generale di Massa sulle cellule
Bilancio di massa sul microorganismo per un CSTR /batch Velocità di accumulo delle cellule Velocità di generazione netta di cellule vive Velocità di cellule in uscita Velocità di cellule in ingresso

26 Bilancio generale di Massa sul substrato
Bilancio di massa sul substrato per un CSTR / batch Velocità di accumulo del substrato Velocità di generazione netta del substrato Velocità del substrato in uscita Velocità del substrato in ingresso

27 Batch: bilancio di Massa sulle cellule
Bilancio di massa sul microorganismo per un Batch No ingresso e uscita Velocità di accumulo delle cellule Velocità netta di generazione di cellule vive

28 Batch: bilancio di Massa sul substrato
Bilancio di massa sul substrato per un batch No input ed output Substrato usato per crescita e per manutenzione Velocità di accumulo del substrato Velocità di substrato usato per crescita cellule e prodotti In fase di crescita A Velocità di substrato usato per manutenzione Nella fase stazionaria B Velocità di formazione prodotto C

29 Esempio: crescita batterica in un reattore batch
Un processo di fermentazione (da glucosio ad etanolo) è condotto in un reattore Batch. Riportare in grafico la concentrazione delle cellule, substrato e prodotto ed anche le velocità di crescita in funzione del tempo. La concentrazione iniziale è di 1.0 g/dm3 e la concentrazione del substrato è 250 g/dm3. Valori dei parametri:

30 Stechiometria Bilancio di massa Leggi cinetiche D Cellule: A G B
Substrato: E Prodotto C F H I J

31 Polymath results Differential equations as entered by the user
d(Cc)/d(t)=rg-rd d(Cs)/d(t)=Ysc*(-rg)-rsm d(Cp)/d(t)=rg*Ypc Explicit equations Rd=Cc*0.01 Ysc=1/0.08 Ypc=5.6 Ks=1.7 m=0.03 umax=0.33 rshghm=m*Cc Kobs=(umax*(1-Cp/93)^0.52) rg=kobs*Cc*Cs/(ks+Cs)

32 Chemostats Chemostats sono dei CSTR che contengono microorganismi
Una delle caratteristiche più importanti è che permettono all’operatore di controllare la crescita cellulare Aggiustando la portata volumetrica della carica Bilancio di massa sulle cellule Bilancio di massa sul substrato Ipotesi: Portata volumetrica costante (uguale in ed out) No cellule in ingresso A B

33 Chemostats Definiamo la velocità di diluizione: D = v0 / V Si ottiene
Reciproco del tempo di residenza medio Si ottiene Cellule: Substrato: In stato stazionario A B C D

34 Chemostats Trascurando la velocità di morte (rd) si ottiene per il flusso in uscita di cellule dal sistema Fc Dividendo per CcV si ottiene … la crescita specifica delle cellule è controllata dalla diluizione Ricordando Monod …. A B D C E

35 Chemostats Supponendo di essere in presenza di un singolo nutriente e che la manutenzione della cellula sia trascurabile Alla fine si ottiene: A B C