Spettrometria di Massa

Presentazione sul tema: "Spettrometria di Massa"— Transcript della presentazione:

1 Spettrometria di Massa

2 Cos’è uno spettrometro di massa
Lo spettrometro di massa è uno strumento che produce ioni e li separa in fase gassosa in base al loro rapporto massa/carica (m/z). Un’analisi mass spettrometrica può essere rappresentata dai seguenti passaggi: Introduzione del campione – Ionizzazione – Analisi della massa – Rivelazione degli ioni/analisi dei dati.

3 Scopi della spettrometria di massa
Determinazione del peso molecolare Delucidazione della struttura molecolare Identificazione di componenti di una miscela Indagini quantitative Studi meccanicistici Studio di interazioni intermolecolari

4 Aree di interesse Proteomica Glicobiologia Genetica e medicina
Biologia molecolare e cellulare Scienze ambientali Chimica dei polimeri Antiterrorismo Farmacologia Antidoping Archeologia Astronomia Analisi inorganica …e ancora tante altre

5 Caratteristiche della spettrometria di massa
Intervallo di PM fino a centinaia di kDa Sensibilità dell’ordine delle picomoli o inferiore Acquisizione veloce dei dati Interfacce con metodi separativi Alta e bassa risoluzione

6 Spettrometria di massa
Le molecole sono molto piccole! Ci vogliono approsimativamente molecole di acqua per fare un grammo! Per pesare le molecole conviene usare il dalton (Da). 1 Da corrisponde alla dodicesima parte dell'atomo di carbonio (12C). In questa scala l'ossigeno (16O) pesa 15,9949 e l'idrogeno (1H) pesa 1, L'acqua pesa quindi circa 18 (18, ).

7 Alcune definizioni Massa Nominale: Massa Esatta: Peso Atomico:
e' coincidente con il numero di protoni e neutroni che contiene l'isotopo. Lo spettrometro di massa misura il rapporto massa/carica degli ioni: e' quindi in grado di distinguere i singoli isotopi di ciascun elemento. Massa Esatta: e' la massa "relativistica" dell'isotopo; non coincide quindi con la somma delle masse esatte dei protoni e neutroni contenuti, ma e' determinata anche dall'energia di legame (nucleare). L'unita' di misura e' ottenuta ponendo uguale a 12 esatto la massa dell'isotopo 12C. Peso Atomico: (quello usato in stechiometria, per intendersi): e' la media ponderale delle masse esatte degli isotopi presenti in natura di quel particolare elemento.

8 Relative Isotope Abundance of Common Elements:
Relative  Abundance Carbon 12C 100 13C 1.11 Hydrogen 1H 2H .016 Nitrogen 14N 15N .38 Oxygen 16O 17O .04 18O .20 Sulfur 32S 33S .78 34S 4.40 Chlorine 35Cl  37Cl 32.5 Bromine 79Br 81Br 98.0

9 Quali sono i componenti di uno spettrometro di massa?
Sistema di introduzione rivelatore analizzatore Sorgente ionica

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11 Spettro di massa                                                                                                                                                                          

12 Modalità di ionizzazione
Hard Ionization: Ionizzazione elettronica Electron Ionization (EI) Soft Ionization: Ionizzazione chimica Chemical Ionization (CI) Bombardamento con atomi veloci Fast Atom Bombardment (FAB) Ionizzazione termospray Thermospray Ionization (TSP) Ionizzazione elettrospray Electrospray Ionization (ESI) Ionizzazione chimica a pressione atmosferica Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) Desorbimento laser assistito da matrice Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI)

13 Impatto elettronico EI

14 Problemi con EI Lo ione molecolare può non essere visibile
Eccessiva frammentazione La sostanza deve essere volatilizzata

15 Ionizzazione chimica CI

16 Gli analizzatori Magnetico
Gli ioni sono accelerati da un intenso potenziale elettrostatico verso l’analizzatore. Un campo magnetico è in grado di far deviare particelle cariche in movimento, per cui gli ioni provenienti dalla sorgente possono seguire la curvatura del tubo. L’entità della deviazione dipende dall’intensità del campo magnetico, dall’energia fornita dal potenziale elettrostatico e dal rapporto m/z dello ione. In particolare per ogni valore di potenziale elettrostatico e campo magnetico, solo ioni con un ben preciso rapporto m/z riusciranno ad attraversare la fenditura posta alla fine dell’analizzatore, ed arrivare quindi al collettore di ioni, che genera un segnale elettrico dipendente dall’intensità della corrente ionica che lo colpisce.

17 Quadrupolo L'analizzatore a quadrupolo consiste in un tubo rettilineo in cui è fatto il vuoto ed in cui sono presenti quattro barre parallele, disposte simmetricamente intorno all'asse del tubo, di sezione circolare oppure iperbolica. Le barre diametralmente opposte sono in contatto elettrico tra di loro, mentre tra barre adiacenti è applicata un voltaggio formato da due componenti: una differenza di potenziale continua e una oscillante ad alta frequenza. Lo ione entra nell'analizzatore parallelamente all'asse z, ed è spinto dai campi elettrici continuo e oscillante a seguire una traiettoria a spirale.

18 Informazioni ottenibili dalla spettrometria di massa
Peso molecolare della sostanza sotto indagine Frammentazioni

19 MS Picchi isotopici: HCl BILANCIA H35Cl MW 36 (75%) H37Cl MW 38 (25%)
m/z 36 (75%) m/z 38 (25%) Sorg. Analizzatore MS 6.021023 molecole = 1 mol = g BILANCIA

20 MS Picchi isotopici: EtOH BILANCIA CH313CH2OH MW 47 1.1% CH3CH2OH
m/z 46 m/z 47 (2.2 %) Sorg. Analizzatore MS 6.021023 molecole = 1 mol = g BILANCIA

21 M+1 M+2 Picchi isotopici 1.1%(numero di C)+ 0.36%(numero di N)
Cl (33% di M) Br (100% di M) S (4% di M)

22 Tecniche di desassorbimento
Sorgente FAB Sorgente MALDI Sorgente ESI Non richiedono volatilizzazione

23 The Nobel Prize in Chemistry 2002
“For the development of methods for identification and structures analysis of biomolecules” Electrospray Ionization Laser Desorption

24 Ionizzazione Elettrospray (ESI)

25 Ionizzazione elettrospray
Tecnica di ionizzazione in fase liquida a pressione atmosferica Ionizzazione delicata Molecole di polarità medio-alta Composti con basso ed alto PM fino a Spesso si formano ioni con carica multipla Comune la presenza di ioni addotto La fase mobile deve essere polare

26 Dettaglio dell’ugello elettrospray
Guaina di N2 Sonda riscaldata ESI Ago ESI Pennacchio di ioni ±5 kV Gas di nebulizzazione N2

27 Meccanismo dell’elettrospray
Goccioline contenenti ioni Capillare ±5 kV Col procedere dell’evaporazione delle goccioline, il campo aumenta e gli ioni si muovono verso la superficie Raggiungimento del limite di Raleigh ed esplosione coulombica che rilascia gli ioni

28 Ionizzazione elettrospray

29 Ionizzazione elettrospray

30 ESI-MS Spectrum of Ubiquitin (MW 8564 Da)
661.26 715.99 786.97 859.66 955.00 +13 +12 +11 +10 +9 +8 Nessuna Frammentazione Formazione di Ioni Multicarica

31 Spettro Deconvoluto dell’Ubiquitina
Ubiquitina Intatta Ubiquitina Ossidata Ubiquitina Carbossilata

32 Prestazioni Generali della Sorgente ESI
Vantaggi Funziona bene con analiti volatili e non volatili, ionici e/o polari Informazioni sul peso molecolare Scarsa frammentazione Elevata sensibilità Permette la determinazione di alti pesi molecolari Interfacciamento con Cromatografia Liquida Svantaggi Scarsa frammentazione Non compatibile con l’utilizzo di tamponi non volatili e solventi organici apolari. Ionizzazione inibita da alte concentrazioni saline

33 Ionizzazione Laser Assistita da Matrice (MALDI)

34 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization MALDI
Il desorbimento mediante laser permette di ottenere ioni in fase gassosa. Le pulsazioni provenienti da un laser a W/cm2 sono focalizzate sulla superficie del campione solido. Le pulsazioni estraggono materiale dalla superficie e creano un microplasma di ioni e di molecole neutre che possono reagire tra di loro in fase vapore. Le pulsazioni laser sono in grado sia di vaporizzare sia di ionizzare il campione.

35 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization MALDI
Principi operativi I passaggio: il composto è mescolato ad una matrice che assorbe intensamente la lunghezza d’onda del laser. La miscela è asciugata e qualunque solvente rimosso. Ne risulta una soluzione solida costituita da analita e cristalli di matrice.

36 Matrix Assisted Laser Desorption Ionization MALDI
II passaggio: le pulsazioni estraggono la soluzione solida ed inducono il riscaldamento della soluzione e la sublimazione della matrice. Una certa energia è trasferita alle molecole di analita che si ionizzano. Il MALDI permette il desorbimento e la ionizzazione di analiti ad altissimo PM (> Da). E’ usato nell’analisi di proteine ad alto PM, polimeri e biopolimeri.

37 1. Sample is mixed with matrix and dried on a sample plate
2. Sample plate is introduced into MALDI source 3. Sample spot is irradiated with laser + To Time of Flight LD consente solo il desorbimento e la ionizzazione di molecole con MW pari a 1000Da per i biopolimeri e 9000 Da per i polimeri sintetici

38 MALDI PROCESS Irradiation H+ Proton transfer Desolvation Desorption Sample Molecules are ionized by proton transfer from the matrix Matrix Sample

39 MALDI-TOF Spectrum of Cytocrome C, Ubiquitin and Myoglobin

40 Matrix Selection Solubility in sample-solvent system
Absorption at the laser wavelenght Photostability Volatility Reactivity Alcune matrici possono ossidare i ponti a disolfuro ed i residui di cisteina e metionina-le aldeidi reagiscono con i gruppi amminici

41 Matrix Application a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)
Peptides (<10 KDa), lipids, carbohydrates Sinapinic acid (SA) Peptides and large proteins (10-150KDa), glycoproteins, membrane proteins Gentisic acid Peptides, proteins, carbohydrates, glycoproteins, glycolipids, polymers, lipids, organic molecules Trans-3-indoleacrylic acid (IAA) Synthetic polymers 3-hydroxypicolinic acid (HPA) Oligonulceotides > 3.5KDa 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP) Oligonucleotides < 3.5KDa Dithranol (DIT) Polymers

42 Prestazioni Generali della Sorgente MALDI
Vantaggi: Analisi di composti con un PM oltre Da Alta Sensibilità (da 100 fmol a 2 pmol) No Ioni multicarica Tolleranza alla presenza di sali, tamponi o altri additivi Analisi di miscele complesse Svantaggi: Analisi di composti con un PM sotto i 600 Da è difficile La risoluzione dell’analizzatore TOF è limitata No analisi di complessi non-covalenti Accoppiamento On-line con un LC or CE è molto difficile.

43 Paragone tra tecniche di ionizzazione MS
200,000 ESI 15,000 1,000 PM FAB EI/CI 10 NON POLARE MOLTO POLARE