Docente: Dr. Stefania Bortoluzzi Dipartimento di Biologia Universita' di Padova viale G. Colombo 3, 35131, Padova Tel. 0039 049 8276214

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2 Docente: Dr. Stefania Bortoluzzi Dipartimento di Biologia Universita' di Padova viale G. Colombo 3, 35131, Padova Tel. 0039 049 8276214 Email: stefibo@bio.unipd.it Corso di Laurea in Biologia Sanitaria Universita' di Padova C.I. DI METODI STATISTICI PER LA BIOLOGIA, INFORMATICA E LABORATORIO DI INFORMATICA (MOD. B ) 8 + 32 ore

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4 http://telethon.bio.unipd.it/bioinfo/Didattica_2006/HomeStatBioinfo.html

5 I e II LEZIONE Allineamento di sequenze Allineamento globale e allineamento locale Allineamento di sequenze a coppie o multiplo Ricerca di similarita’ BLAST

6 ALLINEAMENTO DI SEQUENZE Procedura per comparare due o piu’ sequenze, volta a stabilire un insieme di relazioni biunivoche tra coppie di residui delle sequenze considerate che massimizzino la similarita’ tra le sequenze stesse L’allineamento tra due sequenze biologiche è utile per scoprire informazione funzionale, strutturale ed evolutiva

7 Cosa vuol dire allineare due sequenze (proteine o acidi nucleici)? Scrivere due sequenze orizzontalmente in modo da avere il maggior numero di simboli identici o simili in registro verticale anche introducendo intervalli (gaps – inserzioni/delezioni – indels) seq1: TCATG seq2: CATTG TCAT-G.CATTG 4 caratteri uguali 1 inserzione/delezione

8 ALLINEAMENTO DI SEQUENZE A COPPIE AGTTTGAATGTTTTGTGTGAAAGGAGTATACCATGAGATGAGATGACCACCAATCATTTC ||||||||||||||||||| |||||||| ||| | |||||| ||||||||||||||||| AGTTTGAATGTTTTGTGTGTGAGGAGTATTCCAAGGGATGAGTTGACCACCAATCATTTC MULTIPLO KFKHHLKEHLRIHSGEKPFECPNCKKRFSHSGSYSSHMSSKKCISLILVNGRNRALLKTl KYKHHLKEHLRIHSGEKPYECPNCKKRFSHSGSYSSHISSKKCIGLISVNGRMRNNIKT- KFKHHLKEHVRIHSGEKPFGCDNCGKRFSHSGSFSSHMTSKKCISMGLKLNNNRALLKRl KFKHHLKEHIRIHSGEKPFECQQCHKRFSHSGSYSSHMSSKKCV---------------- KYKHHLKEHLRIHSGEKPYECPNCKKRFSHSGSYSSHISSKKCISLIPVNGRPRTGLKTs

9 Allineamento GLOBALE o LOCALE GLOBALEconsidera la similarita’ tra due sequenze in tutta la loro lunghezza LOCALE considera solo specifiche REGIONI simili tra alcune parti delle sequenze in analisi Global alignment LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRAFGTANCHK ||. | | |.|.| || || | || TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHKAG Local alignment LTGARDWEDIPLWTDWDIEQESDFKTRAFGTANCHK ||||||||.|||| TGIPLWTDWDLEQESDNSCNTDHYTREWGTMNAHK

10 ALLINEAMENTO GLOBALE ALLINEAMENTO LOCALE

11 AACCGAAGGACTTTAATC AAGGCCTAACCCCTTTGTCC AA..CCGAAGGACTTTAATC AACCGAAGGACT TTAATC || |..||...||||...| | |||.|| ||..|| AAGGCTAAACCCCTTTGTCC A AGGCCTAACCCCTTTGTC Fattibile solo per poche sequenze molto brevi! Possono esistere piu’ allineamenti “equivalenti” seq1 AACCGTTGACTTTGACC Seq2ACCGTAGACTAATTAACC AACCGTTGACT..TTGACC | ||||.|||| ||.||| A.CCGTAGACTAATTAACC Allineamento manuale basato sulla massimizzazione del numero residui identici allineati

12 Un metodo molto semplice ed utile per la comparazione di due sequenze e’ quello della MATRICE DOTPLOT A|X X X T| X X G| X T| X X A T C A C T G T A C| X | | | | | | | A|X X X A T C A - - G T A C| X T| X X A|X X X +------------------- A T C A G T A

13 MISURE DI IDENTITA’ E DI SIMILARITA’ Il modo piu’ semplice per definire le relazioni di similarita’ tra nucleotidi e’ basato solo su IDENTITA’ e DIVERSITA’. La piu’ semplice matrice di similarita’ per i nucleotidi e’ la “UNITARY SCORING MATRIX”, matrice che assegna punteggio 1 a coppie di residui identici e 0 ai mismatches. A C G T --------- A | 1 0 0 0 C | 0 1 0 0 G | 0 0 1 0 T | 0 0 0 1 Possono esserci altri criteri per dare un peso diverso da zero a matches tra residui non identici (ad.es. pesare in modo diverso transizioni e transversioni)

14 MISURE DI IDENTITA’ E DI SIMILARITA’ E’ possibile misurare la similarita’ tra aminoacidi tenendo conto delle loro proprieta’ chimico-fisiche ad. es. l’ acido glutammico e’ piu’ simile all’acido aspartico che alla fenilalanina Un altro modo per misurare la similarita’ tra aminoacidi e’ fondato sulle frequenze osservate di specifiche sostituzioni aminoacidiche in opportuni gruppi di allineamenti. La similarita’ tra due specifici aminoacidi, diciamo A e G, e’ proporzionale alla frequenza con cui si osserva la sostituzione A->G. Le MATRICI DI SOSTITUZIONE piu’ conosciute ed utilizzate sono le matrici PAM (o Dayhoff Mutation Data (MD) Matrices) e le matrici BLOSUM.

15 Matrici di sostituzione Le matrici di sostituzione si basano su evidenze biologiche Le differenze che si osservano tra sequenze omologhe negli allineamenti sono riconducibili ad eventi di mutazione Alcune di queste mutazioni hanno effetti trascurabili sulla struttura/funzione della proteina

16 Esempio di matrice di sostituzione ARNK A5-2 R-7 3 N--70 K---6 Nonostante K e R siano due amminoacidi diversi, hanno uno score positivo. Perchè? Sono entrambi amminoacidi carichi positivamente.

17 MATRICI PAM (Dayhoff et al. 1978) Sono basate sul concetto di mutazione puntiforme accettata, Point Accepted Mutation (PAM) Le prime matrici PAM sono state compilate in base all’analisi delle sostituzioni osservate in un dataset costituito da diversi gruppi di proteine omologhe, ed in particolare su 1572 sostituzioni osservate in 71 gruppi di sequenze di proteine omologhe con similarita’ molto alta (85% di identita’) La scelta di proteine molto simili era motivata dalla semplicita’ dell’allineamento, senza necessita’ di introdurre correzioni per le multiple hits (sostituzioni come A->G->A or A->G->N)

18 MATRICI PAM L’analisi degli allineamenti mostro’ come diverse sostituzioni aminoacidiche si presentassero con frequenze anche molto differenti: le sostituzioni che non alterano “seriamente” la funzione della proteina, quelle “accettate” dalla selezione, si osservano piu’ di frequente di quelle “distruttive”. La frequenza osservata per ciascuna specifica sostituzione (es. A  G) puo’ essere usata per stimare la probabilita’ della transizione corrispondente in un allineamento di proteine omologhe. Le probabilita’ di tutte le possibili sostituzioni sono riportate nella matrice PAM

19 Matrici BLOSUM - Blocks Substitution Matrix (Henikoff and Henikoff, 1992) Matrici di sostituzione derivate dall’analisi di oltre 2000 blocchi di allineamenti multipli di sequenze, che riguardavano regioni conservate di sequenze correlate. Per ridurre il contributo di coppie di amminoacidi di proteine altamente correlate, gruppi di sequenze molto simili sono state trattate come se fossero sequenze singole ed e’ stato calcolato il contributo medio di ciascuna posizione. Utilizzando diversi cut-off per il raggruppamento di sequenze simili si sono ottenute diverse matrici BLOSUM (BLOSUM62, BLOSUM80, …)  Il nome della matrici indica la distanza evolutiva (BLOSUM62 è stata creata usando sequenze che non avevano più del 62% di identità)

20 BLOSUM62 Substitution Matrix

21 L’utilizzo della matrice di similarita’ appropriata per ciascuna analisi e’ cruciale per avere buoni risultati. Infatti relazioni importanti da un punto di vista biologico possono essere indicate da una significativita’ statistica anche molto debole. Sequenze poco divergenti     molto divergenti BLOSUM80BLOSUM62BLOSUM45 PAM1 PAM120PAM250

22 ALGORITMI PER L’ALLINEAMENTO DI SEQUENZE Algoritmo di Needleman & Wunsch  allineamento globale Algoritmo di Smith & Waterman  allineamento locale

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24 Siamo a manhattan! Abbiamo molte cose da visitare e solo strade a senso unico. Vogliamo determinare il percorso che ci porta da un estremo all’altro del quartiere e che ci premette di visitare il massimo numero di attrazioni Manhattan Tourist Problem (MTP)

25 Imagine seeking a path from source to sink to travel (only eastward and southward) with the most number of attractions (*) in the Manhattan grid Sink * * * * * * * ** * * Source

26 MTP 324 073 33 0 132 4 4 5 6 4 6 5 5 8 2 2 5 0123 0 1 2 3 j coordinates i coordinates 13 source sink 4 3240 10 2 43 3 1 1 2 2 2 4 19 95 15 23 0 20 3 4

27 MTP: Greedy Algorithm Is Not Optimal 125 2 1 5 23 4 00 0 5 3 0 3 5 0 10 3 5 5 1 2 promising start, but leads to bad choices! source sink 18 22

28 MTP: An Example 324 073 33 0 132 4 4 5 6 4 6 5 5 8 2 2 5 0123 0 1 2 3 j coordinates i coordinates 13 source sink 4 3240 10 2 43 3 1 1 2 2 2 4 24 95 20 35 0 25 3 4 9 14 7 5 9 14 10 14 20 17 22 30 22 32 15

29 ALGORITMO DI NEEDLEMAN & WUNSCH PER L’ALLINEAMENTO GLOBALE Questo metodo permette di determinare l’allineamento globale ottimale attraverso un’interpretazione computazionale della matrice dotplot. L’allineamento ottimale viene calcolato ricorsivamente per sottosequenze via via piu’ lunghe, cosa possibile in virtu’ dell’indipendenza e dell’additivita’ dei punteggi. Le sequenze vengono comparate attraverso una matrice 2D, le celle rappresentanti matches hanno punteggio 1 (0 per i mismatches). L’algoritmo prevede una serie di somme successive dei punteggi contenuti nelle celle, che da’ luogo ad una matrice di punteggi, la cui analisi permette la costruzione dell’allineamento. Alla fine delle iterazioni il punteggio della cella piu’ in alto a sinistra rappresenta il punteggio totale dell’allineamento, senza considerare le gap penalties.

30 Needleman-Wunsch Algorithm Tre fasi 1.Determinazione residui identici 2.Per ogni cella, cercare il valore massimo nei percorsi che dalla cella stessa portano all’inizio della sequenza e dare alla cella il valore del maximum scoring pathway 3.Costruire un allineamento (pathway) andando indietro dalla cella con il punteggio piu’ alto fino all’inizio delle sequenze per ottenere l’allineamento ottimale

31 Needleman-Wunsch Algorithm – FASE 1 Similarity values valore 1 oppure 0 ad ogni cella, in base alla similarita’dei residui corrispondenti Nell’esempio: –match = +1 –mismatch = 0

32 Needleman-Wunsch Algorithm – FASE 2 Per ogni cella, voglio determinare il valore massimo possibile per un allineamento che termini in corrispondenza della cella stessa Cerco le celle appartenenti alla colonna e alla riga precedenti a quelle della cella per trovare il valore massimo in esse contenuto Aggiungo questo valore al valore della cella corrente Procedo da “in alto sinistra” verso “in basso a destra” nella matrice

33 Needleman-Wunsch Algorithm – FASE 3 Costruisco l’allineamento Il punteggio dell’allineamento e’ cumulativo (posso sommare lungo i percorsi nella direzione stabilita) Il miglior allineamento ha il massimo punteggio (ovvero il massimo numero di matches) Questo massimo numero di matches si ritrovera’ nelle ultime righe o colonne L’allineamento si costruisce andando indietro alla cella1,1 a partire dalla cella del massimo numero di matches MP-RCLCQR-JNCBA | || | | | | | -PBRCKC-RNJ-CJA

34 Needleman-Wunsch Algorithm – FASE 3 MP-RCLCQR-JNCBA | || | | | | | -PBRCKC-RNJ-CJA

35 Allineamento locale. Perchè? Sequenze diverse possono presentare una o piu’ brevi regioni di similarità pur essendo diverse nelle restanti regioni. Queste potrebbero risultare non allineabili con un metodo per allineamento globale di sequenze. Esempio: I geni Homeobox mostrano una regione di sequenza altamente conservata, codificante l’omeodominio, un dominio legante il DNA. Un allineamento globale tra sequenze di fattori di trascrizione diversi con omeodominio potrebbe non individuare la corrispondente regione di similarita’

36 ALGORITMO DI SMITH & WATERMAN PER L’ALLINEAMENTO LOCALE Lo scopo degli algoritmi di allineamento locale di due sequenze e’ trovare la regione piu’ lunga della prima sequenza che produce un allineamento ottimale, dati certi parametri, con una regione della seconda.

37 ALGORITMO DI SMITH & WATERMAN PER L’ALLINEAMENTO LOCALE  Anche il metodo di Smith and Waterman utilizza una matrice per comparare le due sequenze  Il valore numerico contenuto in ciascuna cella rappresenta il punteggio dell’allineamento locale che termina ai due residui corrispondenti  I valori inferiori a 0 vengono posti a 0  Cosi’, l’identificazione dei punteggi piu’ alti nella matrice permette di trovare i migliori allineamenti locali tra le due sequenze. Per misurare la bonta’ degli allineamenti si definiscono due funzioni: SIMILARITY SCORE dipende dal PUNTEGGIO PER IL MATCH di residui e dal numero di matches GAP PENALTY dipende dal numero e dalla lunghezza dei gaps

38 GAP PENALTY SIMILARITY SCORE MATCHES MISMATCHES GAPS CALCOLO DEL PUNTEGGIO PER UN ALLINEAMENTO Data una coppia di sequenze Sa e Sb Per ogni coppia di elementi a i e b j di Sa e Sb si definisce un punteggio s(a i,b j ) s(a i,b j ) =  se a i = b j s(a i,b j ) =  se a i  b j, con  >  Ad ogni ogni gap viene assegnato un punteggio dato da: W k =  +  (k-1) Dove W k e’ una funzione lineare che assegna una penalita’ constante alla presenza del gap ( , ad es. -10) e una penalita’ proporzionale alla lunghezza del gap meno uno.  (gap opening penalty, GOP)  (gap extension penalty, GEP) Il punteggio complessivo risultera’:  (s(a i,b j ) ) +  ( W k )

39 ATTCCGAG | || A----GAC CALCOLO DEL PUNTEGGIO PER UN ALLINEAMENTO Sequenze:Possibile allineamento: ATTCCGAG AGAC Assegno i seguenti punteggi: Match: +2 Mismatch: -1 GOP: -5 GEP: -2 MATCHES33 x 2 = 6 MISMATCHES1 1 x –1 = -1 SIMILARITY SCORE 6 –1 = 5 GAPS1 (lungo 4 nucleotidi)  GOP + GEP X 3 GOP-5 GEP-2 x 3 GAP PENALTY-5 + (3 x –2) = -11 PUNTEGGIO FINALE5 – 11 = -6

40 RICERCA DI SIMILARITÀ Una sequenza “da sola” non e’ informativa, deve essere analizzata comparativamente al contenuto dei database perche’ possano essere formulate delle ipotesi sulla sue relazioni evolutive con sequenze simili o sulla sua funzione. Domande cui si puo’ rispondere con una ricerca di similarita’: Data una sequenza, ci sono cose simili nel database? Ho trovato un nuovo gene o una nuova proteina? Il gene ha somiglianze con qualche altro gene nella stessa specie o in altre specie? Fare ipotesi sulla funzione di una proteina Trovare le regione di sovrapposizione tra sequenze contigue Trovare la regione genomica codificante un trascritto Studiare l’evoluzione di popolazioni o specie

41 RICERCA DI SIMILARITÀ SIMILARITA’  ?  OMOLOGIA OMOLOGIA proprieta’ di caratteri (sequenze) dovuta alla loro derivazione dallo stesso antenato comune SIMILARITA’ “grado” di somiglianza tra 2 sequenze La similarita’ osservata tra due sequenze PUO’ indicare che esse siano omologhe, cioe’ evolutivamente correlate La similarita’ e’ una proprieta’ quantitativa, si puo’ misurare L’omologia e’ una proprieta’ qualitativa, non si puo’ misurare. La similarita’ tra sequenze si osserva, l’omologia tra sequenze si puo’ ipotizzare in base alla similarita’ osservata. Percentuale di similarita’ Ricerca di similarita’

42 OMOLOGIA E OMOPLASIA Omologia similarita’ dovuta a derivazione dallo stesso antenato comune Omoplasia similarita’ dovuta a convergenza, stessa pressione selettiva su due linee evolutive puo’ condurre a caratteri simili ORTOLOGIA E PARALOGIA OMOLOGIA ANTENATO COMUNE ORTOLOGIAPARALOGIA PROCESSO DI SPECIAZIONEDUPLICAZIONE GENICA Descrivo le relazioni tra geni di una famiglia intraorganismo (paralogia) o tra diversi organismi (ortologia )

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44  Dimensioni delle banche dati  Ripetitività delle ricerche  Lentezza degli algoritmi “esatti” Sistemi rapidi ma approssimati di allineamento Metodi euristici per l’allineamento gli algoritmi esatti effettuano delle ricerche esaustive ed esplorano tutto lo spazio degli allineamenti possibili (programmazione dinamica) si tratta comunque di algoritmi di ordine n 2, ovvero per allineare due sequenze lunghe ognuna 1000 residui, effettuano 1000x1000 = un milione di confronti: troppo lenti!!!! la crescita esponenziale delle dimensioni delle banche dati di sequenze biologiche ha portato allo sviluppo di programmi (come FASTA e BLAST) in grado di effettuare velocemente ricerche di similarità, grazie a soluzioni euristiche che sono basate su assunzioni non certe, ma estremamente probabili. In pratica la ricerca è resa più veloce a scapito della certezza di avere veramente trovato la soluzione migliore.

45 BLAST Basic Local Alignment Search Tool (Altschul 1990) L’ algoritmo di BLAST e’ euristico e opera: 1Tagliando le sequenze da comparare in piccoli pezzi (parole) 2Ignorando tutte le coppie di parole (sequenza query/database) la cui comparazione da’ un punteggio inferiore ad un limite fissato 3Cercando di estendere tutte le hits rimanenti sino a che l’allineamento locale raggiunge un certo punteggio Dati una SEQUENZA QUERY ed un DATABASE DI SEQUENZE, BLAST ricerca nel database “parole” di lunghezza almeno “W” con un punteggio di similarita’ di almeno “T” una volta allineate con la sequenza “query” (HSP, High Scoring Pairs). Le “parole” selezionate vengono estese, se possibile, fino a raggiungere un punteggio superiore a “S” oppure un “E-value” inferiore al limite specificato.

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47 1- Seeding In sequenze di DNA W = 7 In sequenze proteiche W = 2-3

48 Two-hits algorithm Le word-hits tendono a clusterizzare lungo le diagonali L’algoritmo two-hits richiede che le word-hits siano entro una distanza prestabilita

49 2 - Extension La fase successiva comporta l’estensione dei seed L’estensione avviene in entrambe le direzioni Blast ha un meccanismo per decidere quando fermare l’estensione

50 The quick brown fox jumps over the lazy dog ||| ||| ||||| | | || The quiet brown cat purrs when she sees him The quick brown fox jump ||| ||| ||||| | The quiet brown cat purr 123 45654 56789 876 5654 000 00012 10000 123 4345 3 - Evaluation Estensione verso destra >>>> Diamo punteggio +1 a ciascun match –1 a ciascun mismatch. Calcoliamo il drop off score a partire dal massimo raggiunto (punteggio 9). Quando il drop off raggiunge 5, si interrompe l’estensione. Score -> drop off score ->

51 Il risultato di una ricerca di similarita’ e’ una lista dei migliori allineamenti, tra la sequenza query e le sequenze “estratte” dal database. La SIGNIFICATIVITA’ di ciascun allineamento si calcola come P value o E value P value e’ la probabilita’ di ottenere un allineamento con punteggio uguale o migliore di quello osservato Si calcola mettendo in relazione il punteggio osservato (S) con la distribuzione attesa di HSP quando si comparano sequenze random della stessa lunghezza e composizione di quella in analisi (query sequence) Piu’ il P value e’ vicino a 0 piu’ e’ significativo 2x10 -245 e’ meglio do 0.001 !!! E value e’ il numero atteso di allineamenti con punteggio uguale o migliore di quello osservato Piu’ e’ basso piu’ e’ buono

52 ATAGGGCACTTT-GCGATGA ** * *** ** ***** ATTGCCCACGTTCGCGATCG Sequenze allineate Osservazione Ipotesi alternative OMOLOGIA? CASO? Significatività di un allineamento

53 Allineamento (matrice Blosum62, gap=-11) Seq1 V D C - C Y Seq2 V E C L C Y Score 4 2 9-11 9 7 Score = 20 Sequenze randomizzate Seq1 Seq2 C D V Y C C V Y L E C Sequenze originali Seq1 Seq2 V D C C Y V E C L C Y Allineamento (matrice Blosum62, gap=-11) Seq1 Seq2 C D V Y - C C V E Y L C Score = 9 Score 9 -3 -2 7 -11 9 Score allineamento (20) Distribuzione score casuali Frequenza Score Ripetere (es. 10.000 volte) salvando tutti i punteggi

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55 Usare BLAST OPZIONI Sequenza querynucleotidica proteica (sequenza in formato FASTA, GenBank Accession numbers o GI numbers) Databasedatabase di seq. nucleotidiche database di seq. proteiche ProgrammaStandard BLAST (blastn) Standard protein BLAST (blastp) translated blast (blastx, tblastn, tblastx) MEGABLAST PSI-BLAST PHI-BLAST … Blast selection table http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/producttable.shtml

56 Usare BLAST database di seq. nucleotidiche nr All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences (but no EST, STS, GSS, or phase 0, 1 or 2 HTGS sequences). No longer "non- redundant". est Database of GenBank+EMBL+DDBJ sequences from EST division. est_human est_mouse htgs Unfinished High Throughput Genomic Sequences yeast Saccharomyces cerevisiae genomic nucleotide sequences mito Database of mitochondrial sequences vector Vector subset of GenBank(R), NCBI, in month All new or revised GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences alu Select Alu repeats from REPBASE, suitable for masking Alu repeats from query sequences. dbsts Database of GenBank+EMBL+DDBJ sequences from STS division. chromosome Searches Complete Genomes, Complete Chromosome, or contigs form the NCBI Reference Sequence project.

57 Usare BLAST PROGRAMMI Blastn Nucleotide query - Nucleotide db Blastp Protein query - Protein db Translating BLAST attraverso la traduzione concettuale della query sequence o dei database permette di comparare una sequenza nucleotidica con database di proteine o viceversa. Translated query - Protein db blastx Protein query - Translated db tblastn Translated query - Translated db tblastx MEGABLAST usa un algoritmo greedy (ingordo) veloce ed ottimizzato per comparare sequenze che differiscono poco Search for short nearly exact matches blastn con parametri scelti in modo da ottimizzare la ricerca di matches quasi esatti e brevi. Questi si trovano spesso per caso, percio’ utilizza alto E-value, piccola dimensione della parola e filtering PSI-BLAST Find members of a protein family or build a custom position- specific score matrix PHI-BLAST Find proteins similar to the query around a given pattern

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