METODOLOGIE DI BASE PER LA BIOCHIMICA

Presentazione sul tema: "METODOLOGIE DI BASE PER LA BIOCHIMICA"— Transcript della presentazione:

1 METODOLOGIE DI BASE PER LA BIOCHIMICA
E LA BIOTECNOLOGIA AUTORI: NINFA E BALLOU CASA EDITRICE : ZANICHELLI CHIMICA BIOCHIMICA E BIOLOGIA APPLICATA AUTORI: STEFANI E TADDEI CASA EDITRICE: ZANICHELLI

2 CALENDARIO ESERCITAZIONI
Gruppo I esercitazione II III IV V Gruppo A (martedì) 23/10/07 6/11/07 13/11/07 20/11/07 (Pomeriggio) 27/11/07 Gruppo B (giovedì) 25/10/07 8/11/07 15/11/07 22/11/07 29/11/07 Edificio 7 laboratorio BIO/3 Dip.to di Biologia Strutturale e Funzionale

3 pH La concentrazione degli ioni H3O+ in soluzione è particolarmente importante in chimica ed in biologia (funzionalità degli enzimi, legame e rilascio dell’ossigeno da parte dell’emoglobina,…) Il carattere neutro, acido o basico di una soluzione è determinato dal valore di [H3O+] [H+] in soluzione neutra = 10-7 M [H+] in soluzione acida > 10-7 M [H+] in soluzione basica < 10-7 M Per comodità la concentrazione degli ioni H+ è espressa in scala logaritmica, introducendo la funzione di pH pH = -log[H+]

4 pH e pOH Il pH e/o il pOH indicano l’acidità e/o l’alcalinità di una soluzione acquosa Acidità crescente Basicità crescente 7 pH 14 neutralità pOH 7 Basicità crescente Acidità crescente 14

5 Nel caso dell’acqua pura a 25°C:
pH < 7 soluzione acida pH > 7 soluzione basica pH = 7 soluzione neutra pH = - log[H3O+] [H3O+] > 1 · 10-7 [H3O+] < 1 · 10-7 [H3O+] = 1 · 10-7 La funzione pOH può essere impiegata per esprimere la concentrazione degli ioni OH-: pOH = -log[OH-] Nel caso dell’acqua pura a 25°C: pH + pOH= 14

6 ACIDI E BASI ARRHENIUS BRONSTED-LOWRY LEWIS
Si definiscono ACIDI quelle sostanze che in soluzione acquosa liberano ioni H+ e anioni Si definiscono BASI quelle sostanze che in soluzione acquosa liberano ioni OH- e cationi BRONSTED-LOWRY (scambio chimico tra la sostanza acida o basica ed un’altra sostanza) Si definiscono ACIDI quelle sostanze che cedono ioni H+ ad un’altra sostanza Si definiscono BASI quelle sostanze che acquisiscono ioni H+ da un’altra sostanza LEWIS (considera acide anche sostanze che non possiedono atomi di idrogeno da cedere ed è particolarmente importante nell’interpretazioni di reazioni che avvengono in solventi non acquosi) Si definiscono ACIDI quelle specie chimiche che accettano una coppia di elettroni Si definiscono BASI quelle specie chimiche che cedono una coppia di elettroni

7 Acidità Alcune soluzioni acquose di uso comune sono acide:
Succhi Gastrici pH = Succo di Limone pH = Aceto pH = Bibite gassate pH = Vino pH = Pomodori pH = Urina pH = Latte pH =

8 Basicità Altre soluzioni acquose di uso comune sono basiche:
Saliva Umana pH = Sangue Umano pH = Uova Fresche pH = Acqua di Mare pH = Bicarbonato di Sodio (soluzione) pH = 8.4 Carbonato di calcio (soluzione) pH = 9.4 Detergenti con Ammoniaca pH = 10.5 – 11.9

9 pH L’aggiunta di un acido all’acqua determina un aumento
della concentrazione di ioni H+ ed una diminuzione della concentrzione di ioni OH- HA + H2O → A- + H3O+ L’aggiunta di una base determina un aumento della concentrazione di ioni OH- ed una diminuzione della concentrazione di ioni H+ B + H2O → HB+ + OH-

10 pH L’acqua pura ha valori di pH compresi tra 6,5 ed 8,5
Se il pH assume valori non compresi in questo intervallo si assiste a conseguenze gravi attribuibili alla capacità corrosiva dell’acqua, basti pensare alla vita acquatica

11 pH Il sistema più semplice per variare il pH è quello
di aggiungere un acido ad una soluzione basica o viceversa: NaOH + HCl IN SOLUZIONE ACQUOSA H3O+ + OH- + Na+ + Cl- ↔ H2O + Na+ + Cl- In seguito alla variazione di pH si ottiene anche una variazione della concentrazione salina

12 L'elettrodo a pH Il metodo più semplice ed accurato per misurare
il pH consiste nell’utilizzo di un elettrodo a vetro Progettato nel 1919, tale elettrodo è divenuto di uso comune solo negli anni Trenta, quando divennero disponibili degli amplificatori collegabili Al giorno d’oggi, l’elettrodo a pH/pHmetro fa parte dell’equipaggiamento di base di ogni laboratorio

13 Il cuore del sistema è un elettrodo il cui potenziale dipende dal pH
Il pHmetro misura il voltaggio tra due elettrodi immersi in una soluzione Il cuore del sistema è un elettrodo il cui potenziale dipende dal pH

14 Un sistema per misurare il pH consiste di 3 parti
Un elettrodo indicatore di misura Un elettrodo di riferimento Un registratore e misuratore di potenziale L’elettrodo di misura è un elettrodo a vetro sensibile alla [H+] L’elettrodo di riferimento non è sensibile alla variazione della [H+]

15 CLASSIFICAZIONE DEGLI ELETTRODI
Elettrodi indicatori: elettrodi deputati alla misurazione di un determinato parametro, ad es. pH. Tali elettrodi indicatori devono essere accoppiati ad un elettrodo di riferimento, vale a dire un elettrodo avente potenziale noto, costante ed indipendente dalla composizione della soluzione in cui deve essere immerso L’elettrodo di riferimento è generalmente costituito da un metallo a contatto con una fase solida formata da un sale poco solubile del metallo ed immerso in una soluzione elettrolitica contenente l'anione del sale poco solubile Ag Cl-(aq) AgCl(s)

16 Storicamente, uno dei più importanti elettrodi di riferimento è stato l’elettrodo ad idrogeno standard (SHE: standard hydrogen electrode), il quale contiene un elettrodo di materiale inerte (ad es. platino ricoperto di platino nero) posto in una soluzione fissa di HCl, la quale fornisce gli ioni H+. Sull’elettrodo viene gorgogliato idrogeno alla pressione di 105 Pa, ciò che garantisce l’instaurazione del seguente equilibrio: ½H2 ↔ H+ + e- Si tratta comunque di un elettrodo molto scomodo da usare poiché l’idrogeno deve essere presente ad una pressione costante e non devono essere presenti tracce di ossigeno; inoltre, il platino nero si contamina rapidamente.

17 Due esempi importanti sono: Reazioni che avvengono sugli elettrodi:
L’elettrodo di riferimento è generalmente costituito da un metallo a contatto con una fase solida formata da un sale poco solubile del metallo ed immerso in una soluzione elettrolitica contenente l'anione del sale poco solubile. Due esempi importanti sono: KCl Setto poroso l'elettrodo Ag/AgCl/Cl- (Vrif = 0,222 V) l’elettrodo a calomelano Hg/Hg2Cl2/Cl- (Vrif = 0,268 V) Reazioni che avvengono sugli elettrodi: AgCl + e- = Ag + Cl- Hg2Cl2 + 2e- = 2Hg + 2Cl-

18 Ogni elettrodo di riferimento deve essere messo in contatto con la soluzione
da esaminare tramite una giunzione liquida. Tali giunzioni sono generalmente costituite da cloruro di potassio che, diffondendo lentamente all’esterno dell’elettrodo, fornisce una continuità elettrica al circuito. La presenza della giunzione può però dar luogo alla formazione di un potenziale di giunzione di entità ignota e che non può essere mai completamente eliminato. Utilizzando le giunzioni liquide, bisogna assicurarsi che sia la soluzione di cloruro di potassio a diffondere lentamente all’esterno e non la soluzione da esaminare a diffondere all’interno. Sebbene la diffusione verso l’esterno comporti inevitabilmente una certa contaminazione del campione, di norma questo non è considerato un problema, a meno che non debbano essere misurati cloruro o potassio → in tal caso, per evitare la contaminazione, deve essere utilizzato un elettrodo di riferimento a doppia giunzione. Diversi sono i tipi di giunzione attraverso la quale diffonde il KCl: ceramiche, materiale vetrificato, giunzioni fibrose.

19 SISTEMA DI MISURA DEL pH MEDIANTE ELETTRODO A VETRO
Soluzione in esame Elettrodo di riferimento Elettrodo a vetro Elettrodo di riferimento (interno) H+ (interno) ad es. HCl 0.1 M Membrana di vetro H+ (esterno) ad es. analita (esterno) All’interno dell’elettrodo a vetro è contenuto un elettrodo di riferimento argento/argento cloruro (Ag/AgCl/Cl-), circondato da HCl 0,1 M che agisce da elettrolita (la soluzione di riferimento HCl 0,1 M è saturata con KCl) La membrana di vetro separa la soluzione interna da quella esterna Il circuito è chiuso da un secondo elettrodo di riferimento a calomelano o ad Ag/AgCl/Cl-, immerso nella stessa soluzione a pH incognito tramite un ponte salino La differenza di potenziale misurata è quella tra l’elettrodo di riferimento interno e quello esterno.

20 ELETTRODO A COMBINAZIONE
L’elettrodo esterno di riferimento può essere una sonda esterna oppure può essere costruito intorno all’elettrodo a vetro In tal caso il secondo elettrodo di riferimento è contenuto nello stesso corpo dell’elettrodo a vetro L’elettrodo risultante si dice a combinazione ed è una cella elettrochimica La misurazione avviene immergendo nella soluzione il solo elettrodo a combinazione N.B.: nel caso dell’elttrodo a combinazione, il livello della soluzione da analizzare deve essere abbastanza elevato da ricoprire il tappo poroso (giunzione liquida), ma non così tanto da raggiungere il livello della soluzione per il ponte salino (KCl) che si trova nell’elettrodo esterno poiché è necessario che il KCl diffonda lentamente nella soluzione.

21 ELETTRODO ESTERNO DI RIFERIMENTO

22 ELETTRODO INDICATORE Il funzionamento dell’elettrodo di misura, generalmente di vetro, si basa sullo scambio di ioni che si verifica negli strati idratati posti sulla superficie di vetro dell’elettrodo stesso. In prima approssimazione, infatti, il potenziale dell’elettrodo a vetro dipende dalla composizione della membrana stessa dell’elettrodo (una rete di silicati contenente ioni metallici coordinati ad atomi di ossigeno), dal suo stato di idratazione e, naturalmente, dalla concentrazione degli ioni idrogeno nella soluzione interna (nota e costante) e nella soluzione esterna (incognita).

23 La composizione del vetro Corning 015, largamente adoperato
per le membrane degli elettrodi a vetro, è pressappoco la seguente: Na2O 22% CaO 6% SiO2 72% Sono proprio tali ioni metallici coordinati ad atomi ossigeno a scambiare gli ioni H+. Affinchè lo scambio sia possibile, è necessario che le due superfici della membrana siano idratate. L’idratazione avviene mediante reazioni di scambio ionico: H+acq + Na+Gl- = Na+acq + H+Gl- Gl = glass (vetro)

24 Il funzionamento dell’elettrodo a pH si basa sul fenomeno per cui
alcuni tipi di borosilicati sono permeabili agli ioni H+, ma non ad altri cationi o anioni. Il passaggio degli ioni H+ da un lato all’altro della membrana di vetro determina lo sviluppo di un potenziale elettrico attraverso la membrana.

25 pHmetro Elettrodo a vetro Semicella di misura Elettrodo di riferimento
L’elettrodo a vetro è costituito da una membrana di vetro molto sottile e leggera situata all’estremità di un tubo di vetro grosso o a volte in resina epossidica. Poiché l’elettrodo interno di riferimento dà origine ad un potenziale costante, il potenziale variabile fornito dall’elettrodo a vetro può essere paragonato con il potenziale standard generato da un elettrodo esterno di riferimento.

26 V V V = cost – 0,0592 pH a 25°C cost - 2.303 RT/F pH
In sintesi, l’elettrodo a vetro si comporta come una batteria il cui voltaggio dipende dall’attività degli ioni H+ presenti nella soluzione in cui esso si trova immerso. Qualsiasi tipo di elettrodo di riferimento si utilizzi, il voltaggio che viene misurato è pari alla differenza tra quello dell’elettrodo di riferimento e quello dell’elettrodo a vetro. DIFFERENZA DI POTENZIALE AI CAPI DELLA CELLA DI MISURAZIONE V E0 – RT/F log10 [H+]i/[H+]e [H+]i è fissa e pari a 0.1 M che corrisponde alla [HCl] all’interno dell’elettrodo di vetro V cost RT/F pH V = cost – 0,0592 pH a 25°C Il voltaggio generato è direttamente proporzionale al pH

27 V = cost – 0,0592 pH a 25°C Tale equazione tiene conto anche di altri potenziali costanti presenti nel sistema. Tra di essi vi sono: Il potenziale asimmetrico che si genera a cavallo della membrana di vetro anche quando la concentrazione di ioni H+ è uguale da entrambi i lati → ne consegue che immergendo l’elettrodo a vetro nella stessa soluzione presente all’interno dell’elettrodo stesso si misura una differenza di potenziale non nulla Il potenziale di giunzione che si genera a livello della giunzione liquida con l’elettrodo di riferimento → tale potenziale si genera perché gli ioni K+ e Cl- non diffondono esattamente con la stessa velocità e perciò creano un potenziale di modesta entità nella regione tra il campione ed il KCl nell’elettrodo di riferimento

28 Un elettrodo per il pH è adoperato insieme ad un pHmetro
Il pHmetro registra il potenziale dovuto alla concentrazione degli ioni H+, però viene progettato in modo da utilizzare una piccola quota della corrente di circuito Un flusso di corrente troppo elevato provocherebbe delle variazioni nella concentrazione degli ioni e quindi delle variazioni di pH → tutto ciò è evitato dalla presenza di una resistenza molto elevata pHmetro, elettrodo a vetro ed elettrodo di riferimento a calomelano sono costruiti in modo che a pH 7 il potenziale registrato sia nullo

29 IN SINTESI... differenza di potenziale
Due elettrodi, all’interno della soluzione, misurano la differenza di potenziale L’elettrodo di riferimento è contenuto nell’elettrodo indicatore (di vetro) L’elettrodo indicatore contiene una soluzione di HCl 0,1 M che costituisce [H+]I fissa L’elettrodo indicatore misura il potenziale sviluppato, il quale è direttamente proporzionale al pH esterno all’elettrodo Lo strumento traduce la differenza di potenziale in un valore di pH

30 RICORDARSI CHE... E’ importante che la superficie esterna di vetro dell’elettrodo rimanga idratata Per tale motivo l’elettrodo è di norma lasciato immerso in una soluzione La sottile membrana di vetro è molto fragile e quindi bisogna aver cura di non romperla né graffiarla, e nemmeno di causarvi un accumulo di elettricità statica per strofinamento Molti elettrodi a pH di recente costruzione possiedono una protezione di plastica per evitare questi problemi Dopo aver utilizzato l’elettrodo con soluzioni proteiche o gelatinose, è necessario lavare con cura la membrana perché un eventuale deposito di queste sostanze diminuirebbe l’efficacia della misura

31 IL POTENZIALE GENERATO DIPENDE DALLA TEMPERATURA
V = cost – RT/F pH La variazione di una unità di pH provoca una variazione del potenziale di 54.2 mV a 0ºC e di 61.5 mV a 37ºC → si tratta di un effetto completamente prevedibile e che quindi può essere facilmente compensato Più ci si allontana da pH 7 (il punto isopotenziale, dove la temperatura non provoca alcun effetto sul potenziale) e maggiore sarà la compensazione che si deve apportare a causa dell’accumulo di errori Il dispositivo per la compensazione della temperatura del pHmetro deve essere perciò accuratamente calibrato prima della taratura dello strumento

32 TARATURA La taratura richiede l’utilizzo di due soluzioni a pH diverso
Di norma si effettua prima la taratura con un tampone a pH 7 e poi con uno a pH 4 (se il campione si presuppone acido) oppure a pH 9 (se ci si aspetta un campione basico) Dopo la taratura, l’elettrodo a pH è semplicemente immerso nella soluzione in esame e fornirà una misura rapida ed accurata del pH

33 Tali sostanze sono dette indicatori.
INDICATORI DI pH Alcuni acidi e basi deboli di natura organica hanno la proprietà di avere un colore diverso quando sono in forma dissociata rispetto a quando sono in forma indissociata. Tali sostanze sono dette indicatori.

34 HA + H2O ⇄ A- + H3O+ giallo rosso

35 Quando [H3O+] >> Ka la soluzione appare gialla
giallo rosso Quando [H3O+] >> Ka la soluzione appare gialla Quando [H3O+] << Ka la soluzione appare rossa Quando [H3O+]  Ka la soluzione appare arancione pKa = - log10 Ka 2 4 6 1 3 5 7 8 10 12 14 9 11 13 pH

36 INDICATORI DI pH La conoscenza del pKa dell’indicatore consente di avere un riferimento sull’intervallo di pH in cui avviene il cambiamento di colore (viraggio) e di conseguenza una stima approssimativa del pH della soluzione Uno degli indicatori più noti è il tornasole, rosso a pH acido e blu a pH basico L’impiego di stick impregnati con vari indicatori che hanno pKa differenti consente una stima abbastanza accurata del valore del pH della soluzione in cui essi sono immersi

37 Esempi: pKa fenolftaleina blu di bromotimolo metil arancio
2 4 6 1 3 5 7 8 10 12 14 9 11 13 pH fenolftaleina blu di bromotimolo metil arancio rosso fenolo Esempi: pKa

38 PRINCIPALI INDICATORI ACIDO-BASE

39 VARIAZIONI DI COLORE PER ALCUNI INDICATORI
Metilarancio Blu di bromotimolo Fenolftaleina

40 pH E SOLUZIONI TAMPONE Il mantenimento di valori costanti di pH è un requisito fondamentale per i liquidi presenti nel nostro organismo. D’altra parte, è noto che l’aggiunta di modeste quantità di acidi o basi forti a normali soluzioni acquose provoca grandi variazioni di pH. Com’è possibile conciliare questi due fatti? Una soluzione tampone è una soluzione il cui pH non è apprezzabilmente modificato dall’aggiunta di modiche quantità di acidi o basi forti.

41 SOLUZIONI TAMPONE Una soluzione tampone è tipicamente formata da un acido debole (o da una base debole) in presenza della propria base coniugata (o del proprio acido coniugato). Secondo la teoria di Bronsted e Lowry, le soluzioni tampone sono costituite da una coppia acido-base coniugata.

42 Si consideri l’esempio dell’acido acetico e della sua base coniugata,
lo ione acetato presente in un sale come l’acetato di sodio. ACIDO CH3COOH + H2O H3O+ + CH3COO- BASE CONIUGATA CH3COO- + H2O OH- + CH3COOH Cosa succede se si aggiunge una modica quantità di HCl alla soluzione? CH3COO- + HCl Cl- + CH3COOH Lo ione acetato “tampona” la forza acida di HCl, impedendo che si liberino ioni H+ in soluzione. E se si aggiunge una modica quantità di NaOH alla soluzione? CH3COOH + OH H2O + CH3COO- Lo ione idrossido prodotto dalla dissoluzione di NaOH è “tamponato” dall’acido acetico.

43 RIASSUMENDO... In entrambi i casi, non si ha liberazione di ioni H+ o OH- in grado di alterare sensibilmente il pH, ma vengono modificate le proporzioni tra l’acido debole e la sua base coniugata presenti nella soluzione tampone e ciò impedisce una variazione significativa del pH della soluzione Ad ogni modo la variazione di pH non è proporzionale alla quantità di ioni H+ ed OH- inseriti nella soluzione E’ evidente che, affinchè le specie tamponanti possano esercitare la propria funzione, la loro concentrazione deve essere superiore a quella dell’acido o della base forte aggiunta

44 E’ possibile calcolare il pH di una soluzione tampone
E’ possibile calcolare il pH di una soluzione tampone? Sì, ma per far ciò è necessario rielaborare l’espressione della costante di dissociazione acida. +

45 Consideriamo il caso in cui in una soluzione tampone l’acido debole
L’equazione di Henderson-Hasselbalch consente di determinare il pH di una soluzione tampone conoscendo le concentrazioni dell’acido debole e della sua base coniugata, e la costante di dissociazione acida (e quindi il pKa) dell’acido stesso. Consideriamo il caso in cui in una soluzione tampone l’acido debole ed il suo sale sono presenti alla stessa concentrazione → l’equazione di Henderson-Hasselbalch diventa: pH = pKa – log1 = pKa – 0 = pKa In queste condizioni il pH della soluzione è uguale al pKa dell’acido debole. Il pKa di un acido è il valore di pH al quale l’acido è dissociato al 50%. Il pKb di una base è il valore di pH al quale la base è dissociata al 50%.

46 CH3COOH + H2O H3O+ + CH3COO- A bassi valori di pH (per es. pH 3.7) la forma dominante nell’equilibrio chimico è l’acido acetico, mentre ad alti valori di pH (per es. pH 5.7) la forma dominante è quello dello ione acetato. Quando il pH = pKa, l’acido acetico (CH3COOH) è dissociato al 50%. [CH3COOH]=[CH3COO-] Ka=[H3O+] [CH3COO-]/[CH3COOH] pKa = pH Ad un pH pari al pKa si ha il massimo potere tampone di una soluzione.

47 Una soluzione in cui un acido debole ed il suo sale sono presenti in
concentrazioni uguali ha il massimo potere tampone, dal momento che le due specie sono in grado di neutralizzare uguali quantità di acidi e basi forti. Una soluzione tampone può svolgere, tuttavia, la propria funzione anche in condizioni in cui l’acido è presente in concentrazione maggiore rispetto al sale o viceversa, purchè i rapporti tra le concentrazioni delle due specie rimangano all’interno di un intervallo compreso tra 10:1 e 1:10. ovvero pKa -1 < pH < pKa +1 La scelta di una soluzione tampone dipende sempre dal valore di pH che deve essere mantenuto costante. pH = pKa – log 10 1 pH = pKa – log 1 10

48 PREPARAZIONE DI SOLUZIONI TAMPONE
Una soluzione tampone può essere preparata in due modi diversi: Aggiungendo direttamente l'acido (o la base) debole ed il suo sale Esempio: acido acetico ed acetato di sodio, oppure ammoniaca e cloruro di ammonio (Henderson-Hasselbach) Aggiungendo l'acido (o la base) debole ed una base (o un acido) forte Esempio: acido acetico ed idrossido di sodio, oppure ammoniaca ed acido cloridrico

49 SISTEMI TAMPONE FISIOLOGICI
Il pH del sangue e dei liquidi extracellulari è mantenuto a valori prossimi alla neutralità (7,36 - 7,42) grazie a sistemi tampone fisiologici che svolgono questo ruolo fondamentale. Una parte della CO2 prodotta dal metabolismo dei vari tessuti penetra all’interno dei globuli rossi dove, grazie alla catalisi promossa dall’enzima anidrasi carbonica, reagisce con l’acqua per produrre acido carbonico: CO2 + H2O H2CO3 L’acido carbonico si dissocia poi attraverso la seguente reazione: H2CO3 + H2O HCO3- + H3O+

50 Il tampone fosfato funziona attraverso il seguente equilibrio:
H2PO42- + H2O H3O+ + HPO4- Sebbene i fosfati non siano quantitativamente rappresentati nel sangue come i bicarbonati, il loro valore di pKa (7,2) molto prossimo al pH fisiologico del sangue gli conferisce un elevato potere tampone.

51 Un terzo sistema tampone di notevole rilevanza fisiologica è
centrato sulle proprietà acido-base dell’emoglobina (Hb), la proteina dei globuli rossi che trasporta l’ossigeno ai tessuti del nostro organismo. L’emoglobina è presente in grandi concentrazioni (mediamente grammi per litro di sangue) ed esiste in due forme, una protonata ed una non protonata: (nH+) + nH2O Hb + nH3O+ L’equilibrio di dissociazione dell’emoglobina è, in effetti, utilizzato per tamponare la maggior parte dell’acidità prodotta dal metabolismo dei tessuti periferici.