Regolazione della funzione dei canali ionici

Presentazione sul tema: "Regolazione della funzione dei canali ionici"— Transcript della presentazione:

1 Regolazione della funzione dei canali ionici
canale ionico Recettore Enzima effettore 2o messaggero ? Meccanismi potenziali di modulazione di un canale ionico

2 Possibile meccanismo di regolazione di un canale mediante produzione di un 2o messaggero citoplasmatico canale proteina regolatrice fosforilaz. agonista

3 Effetti di Whole-Cell e di singolo Canale
AUMENTO DELLA CORRENTE DI Ba2+ ANDAMENTO TEMPORALE DELLA MODULAZIONE I = i·N·P no ↑ # canali N, no ↑ corr sing canale i ↑ Po di ciascun canale fosforilato

4 La struttura dei canali HCN
Appartengono alla classe dei canali HCN: “canali cationici attivati dall’iperpolarizzazione”. Vengono attivati alla fine di ogni pda, quando la membrana si iperpolarizza. La loro apertura genera una corrente entrante che, depolarizzando la membrana, produce il prepotenziale, quindi il pda successivo. Ciascuna delle 4 subunità presenta: 6-DTM come i canali Kv S4 riconosciuto come sensore del voltaggio per l'elevata presenza di residui carichi positivamente motivo GYG nel linker S5-S6, tipico del filtro di selettività dei canali Kv nel C-terminale è presente un dominio CNB come nei canali CNG si pensa che i canali siano formati da TETRAMERI come i canali Kv indietro

5 Modulazione dei Canali “f”
Di grande importanza è la “modulazione” (variazione della sensibilità al voltaggio) dei canali f operata dall’orto- e dal para-simpatico tramite i rispettivi neurotrasmettitori <noradrenalina(+adrenalina) ed acetilcolina>. Modulando i canali f, l’orto- ed il para-simpatico regolano la frequenza cardiaca (!!), come se fossero l’uno l’acceleratore e l’altro il freno di un’automobile. Questi neurotrasmettitori agiscono su recettori accoppiati a proteine-G e fanno rispettivamente aumentare e diminuire il livello intracellulatre di AMPc. I canali f sono voltaggio-dipendenti, ma anche chemio-dipendenti (dal versante intracellulare), una condizione tutt’altro che infrequente.

6 Significato fisiologico Innervazione ortosimpatica del cuore
ORIGINE: corna laterali midollo toracico (T1-T5) AZIONE: eccitatoria MEDIATORE: noradrenalina BERSAGLI: 1°: recettori b1 dei miociti ventricolari: ICa↑ (eff. Inotropo positivo) 2°: recettori b1 delle cellule pacemaker del nodo SA MECCANISMO: cAMP↑ (If e ICa)↑  frequanza cardiaca↑ (effetto cronotropo positivo) 3°: recettori b1 delle cellule pacemaker del nodo AV MECCANISMO: accelerazione della conduzione del potenziale d’azione attraverso nodo AV e sistema di conduzione (effetto dromotropo positivo, conseguenza dell’e. cronotropo)

7 Possibile meccanismo di regolazione di un canale mediante interazione diretta con una proteina G
Recettore G proteina canale agonista recettore proteina G canale X agonista

8 Certi canali K+ sono effettori di Gi/o
Recettore G proteina i q s t effettore canale enzima La tecnica del patch-clamp, nelle sue varie configurazioni, ha dato un contributo fondamentale a chiarirne il meccanismo d’azione

9 È probabile che sia coinvolta una proteina G PTX-sensibile (Gi/Go)
Utilizzo della configurazione di cell-attached per lo studio dei canali al K+ muscarinici  Nella modulazione di tale canale non è coinvolto un secondo messaggero intracellulare diffusibile Inoltre: Se la cellula è trattata con PTX non c’è alcuna attività neanche con l’Ach nella pipetta  È probabile che sia coinvolta una proteina G PTX-sensibile (Gi/Go)

10 Effetto delle Tossine Batteriche sulla Trasduzione del Segnale
Tossina del colera Vibrio cholerae Tossina della pertosse Bordetella pertussis ADP-ribosilazione di un residuo Arg di Gs-a; attività GTPasica abolita; Gs-a bloccata nello stato attivo monomerico ADP-ribosilazione di un residuo Cys di Gi-a; nessuno scambio di GTP; Gi-a bloccata nello stato inattivo eterotrimerico

11 Inside-out patch Amplificatore Cellula Cell-attached patch Inside-out trazione vescicola esposizione all’aria Nella configurazione di inside-out la parte intracellulare della membrana viene a contatto con l’ambiente esterno

12 L’attivazione di Gi/oporta
Certi canali K+ sono effettori di Gi/o Recettore t s q i G proteina enzima canale effettore Configurazione di cell-attached trasmettitore GTP L’attivazione di Gi/oporta al rilascio di Ga e Gbg + neurotr. n = 0 (chiuso) n = 1 (aperto)

13 Il GTP è importante per attivare questi canali del K
Configurazione di inside-out L’elettrodo è allontanato dalla cellula per distaccare il patch di membrana La configurazione di “inside-out” permette l’accesso alla superfice interna della membrana GTP no GTP Þno G* n= 0 (chiuso) Nessuna apertura del canale +GTP n = 0 (chiuso) n = 1 (aperto)

14 Attivazione canali GIRK in Inside-out patch mediante GTP o GTPgS

15 Quale subunità di Gi/Go è coinvolta nella modulazione?
Configurazione di inside-out L’elettrodo è allontanato dalla cellula per distaccare il patch di membrana Gai/o +G*ai/o Nessuna apertura del canale

16 Quale subunità di Gi/Go è coinvolta nella modulazione?
Configurazione di inside-out L’elettrodo è allontanato dalla cellula per distaccare il patch di membrana Gbg +Gbg n = 0 (chiuso) n = 1 (aperto)

17 Log (tempi di apertura ms)
N. degli eventi Log (tempi di apertura ms)

18 Modello cinetico ipotizzato
lungo breve Il canale GIRK si trova in uno stato chiuso C0 in assenza di Gbg. Il legame di Gbg al canale porterebbe alla transizione al lungo stato chiuso C1, collegato allo stato aperto breve O1. Il legame di un’altra Gbg al canale porterebbe alla transizione allo stato chiuso breve C2, collegato allo stato aperto lungo O2. breve lungo Gli intervalli chiusi brevi (C2) tendono ad essere preceduti dagli intervalli aperti lunghi (O2) e viceversa, escludendo modelli del tipo:

19 Attivazione dei Recettori Muscarinici M2
ACh rallenta la velocità del cuore e indebolisce la contrazione M2 R (muscolo cardiaco) Azione: Apertura dei canali GIRK Particolarmente importante nel nodo SA delle cellule pacemaker Si sviluppa molto più velocemente ( ms di latenza) di quanto i recettori b-adrenergici ↑Ica nei miociti Esperimenti di patch-clamp suggeriscono un meccanismo relativamente diretto Riduzione indiretta della ICa presinaptica via Go nei neuroni causando iperpolarizzazione Riduzione diretta delle correnti N-P/Q-type presinaptiche

20 Significato fisiologico a livello post-sinaptico
Nei neuroni anche l’attivazione di altri recettori a 7 domini transmembrana come as es. i recettori GABAB può attivare canali GIRK Sulla cellula postsinaptica: Apertura di una conduttanza K+ (GIRK)  Iperpolarizzazione (PPSI tardivo)

21 Modulazione dei canali del Ca2+ di tipo N
Background: • I canali di tipo N (e P/Q) sono particolarmente espressi a livello presinaptico. • L’attivazione di questi canali causa un ingresso di calcio che porta al rilascio del neurotrasmettitore. • L’attivazione di recettori accoppiati a G-proteine sono in grado di inibire questi canali. • Ciò influenza la quantità di neurotrasmettitore liberato e quindi la forza della trasmissione sinaptica.

22 Esperimenti in whole cell
perfusione elettrodo Ba M2 muscarinici GABAB e m Oppioidi a-adrenergici Ecc.

23 Una proteina G è coinvolta nel processo di modulazione
L’attivazione di recettori a 7 domini transmembrana modula – inibendoli – i canali di tipo N e P/Q Tale inibizione è mimata anche dal GTP-gS indipendentemente dall’attivazione del recettore Una proteina G è coinvolta nel processo di modulazione

24 È coinvolta una proteina G del tipo Gi/o
Se le cellule sono trattate con tossina della pertosse (PTX) l’inibizione mediata dal recettore a 7 DT è trascurabile È coinvolta una proteina G del tipo Gi/o

25 cellula trattata con PTX
In cellule trattate con PTX, l’inibizione dei canali N e P/Q può essere ripristinata in seguito all’iniezione di proteine G esogene del tipo Gi/o purificate Vr=-70 mV Vt=+10 mV t1 Contr Ach t3 t2 % inibizione agonista cellula trattata con PTX

26 Interazione del dimero Gbg con la subunità a1 di un canale del calcio non-L

27 Il legame di Gbg al canale è voltaggio-dipendente!
Esperimenti in whole cell

28 Canali N-type non modulati
Esperimenti in cell attached senza neuromodulatore • Attivazione rapida con un pattern di bursting denso • Il prepulse non ha effetto sulle caratteristiche del gating o sulla corrente media • Latenza alla prima apertura invariata • Le distribuzioni dei tempi di apertura e di chiusura sono pure invariate.

29 Canali N-type sotto inibizione
• in presenza di Ach 50 mM • Senza prepulse, osserviamo: • Ritardo più prolungato rispetto alla prima apertura • Aperture brevi e lunghi periodi di chiusura, possono revertire a un bursting denso. •Conseguenze: • Correnti medie con fase di attivazione lenta Con un prepulse, l’attività del canale è revertita: appare come quella di un canale non inibito

30 Schema cinetico della modulazione inibitoria dei canali del calcio di tipo N
Gbg + tslow=1/(k1[G]+k2)