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Struttura dei geni batterici
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La replicazione è semiconservativa
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La replicazione è semidiscontinua
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La replicazione è bidirezionale
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(Cairns, 1961)
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Struttura dei geni batterici
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RNA polimerasi
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l’elica 3’-5’ del DNA funge da stampo per la sintesi dell’RNA (5’-3’)
nucleotidi inseriti in base alle regole della complementarità RNA: ribosio invece del desossiribosio e U al posto di T
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la sequenza “codificante” del DNA è uguale a quella del messaggero
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La sequenza è conservata
promotore: sequenza presente a monte di tutti i geni, riconosciuta dal fattore sigma dell’RNA polimerasi, necessaria per l’inizio della trascrizione. La sequenza è conservata promotori riconosciuti dal fattore sigma-70 di E. coli
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lettera minuscola = basi presenti in molti casi ma non sempre
mutazioni “down”: diminuisce l’efficienza del promotore TTGACa TAtAaT lettera maiuscola = basi più conservate (presenti in quella posizione rispetto al +1 in quasi tutti i casi lettera minuscola = basi presenti in molti casi ma non sempre
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regolazione dell’espressione genica mediante l’intervento di fattori sigma alternativi
geni “heat-shock”: CCCCCC - 15/17 basi - CCCC promotore riconosciuto dal fattore sigma32 attivato solo in caso di aumento della temperatura. I geni che hanno questo promotore vengono espressi (trascritti) SOLO IN PRESENZA DI QUESTO SPECIFICO FATTORE SIGMA geni “spo” in B. subtilis sono silenti e vengono trascritti solo durante la sporulazione per la presenza di fattori sigma specificamente attivati in sporulazione
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SEQUENZE PALINDROMICHE: sequenze ripetute e
invertite rispetto all’asse di simmetria le sequenze sono specularmente complementari 5’- TGCA- 3’ 3’- ACGT - 5’ lette allo stesso modo su entrambi i filamenti del DNA (nella stessa direzione)
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5’-ATCCGGAT-3’ 3’-TAGGCCTA-5’ palindrome perfetta a 8 coppie di basi palindromi perfette = siti di restrizione (endonucleasi specifiche) 5’-ATCCAAGTACGGAT-3’ PALINDROME IMPERFETTA 3’-TAGGTTCATGCCTA-5’ (terminatori della trascrizione)
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Terminatore forte o rho-indipendente:
struttura secondaria stabile e forte per la presenza di molte G e C nello “stem” sequenza di tante U al 3’ della struttura secondaria (che facilita la separazione dell’ibrido DNA/RNA)
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Terminatore forte o rho-indipendente
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Terminatore debole o rho-dipendente
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Terminatore debole o rho-dipendente
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Ordinare i seguenti promotori in base alla loro forza partendo da quello più forte:
a) TTAACC basi CCTAAG b) TTGACC " TATATT c) TTGACA " TATAAT d) CTGACA " CATAAT sequenza consenso: TTGACa TAtAaT
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Indicare quale delle seguenti palindromi è imperfetta
ATGCAT ATGCTA TTACAACCCTGTAA TACGTA TACGAT AATGTTGGGACATT
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5’- tcCACCGGCTGCCGaagtgtttaCGGCAGCCGGTGtttttttt - 3’
Scrivere la sequenza di un ipotetico terminatore forte riportando la struttura che esso assume sull'RNA 5’- tcCACCGGCTGCCGaagtgtttaCGGCAGCCGGTGtttttttt - 3’ 3’-agGTGGCCGACGGCttcacaaatGCCGTCGGCCACaaaaa..-5’ g t t g t a t a a G C C G T A A T tcC GUUUUUU
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La sequenza sotto riportata rappresenta un terminatore della trascrizione.
1) Indicare se si tratta di un terminatore forte o debole motivando la risposta 2) riportare la struttura che tale sequenza assume una volta trascritta GAACTCTAGCCCGGCTTAGCCxxxxxxxxxGGCTAAGCCGGGCTTTATATTTT CTTGAGATCGGGCCGAATCGGxxxxxxxxxCCGATTCGGCCCGAAATATAAAA
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Struttura dei geni batterici
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rRNA tRNA
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formazione dell’aminoacil-AMP
attivazione degli aminoacidi formazione dell’aminoacil-AMP
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N-formil-metionil-tRNA (tRNA iniziatore nei batteri)
(archea metionil-tRNA)
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Sintesi proteica: fasi di inizio
Interazione sub. minore del ribosoma con mRNA (complementarità rRNA16S e sequenza SD) Legame del tRNA iniziatore (N-formil-metionina) alla tripletta di inizio AUG legame sub. maggiore del ribosoma 50S
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Fattori di inizio (IF-1, IF-2, IF3)
GTP per fornire energia tRNA iniziatore Interazione sub minore + mRNA (16S + sequenza SD)
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SEQUENZA DI SHINE-DALGARNO: legame con il 16S della sub
SEQUENZA DI SHINE-DALGARNO: legame con il 16S della sub. minore del ribosoma rRNA 16S SD Tripletta di inizio AUG Sequenza codificante
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Ribosoma: sito A = sito “accettore” (interazione con tRNA carico) Sito “P” = formazione del legame peptidico con l’aa “nuovo” Sito “E” = sito di uscita del tRNA “scarico”
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Legame aa2-tRNA al sito A
Legame aa1 (sito P) con aa2 (sito A)
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Legame peptidico tra il gruppo NH2 dell’aa “nuovo” (sito A) e il gruppo COOH dell’aa precedente (sito P). Il peptide si accresce di un aa. Il tRNA del sito P si “scarica” e si allontana (sito E).
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Il ribosoma trasloca e il tRNA che porta la catena di aa si troverà nel sito P.
Il sito A è vuoto e presenta una nuova tripletta per il legame con il corrispondente tRNA carico La traslocazione è catalizzata dall’idrolisi del GTP. La formazione del legame peptidico non richiede altra energia perche il legame tra tRNA e aa è ad alta energia
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TERMINAZIONE DELLA SINTESI PROTEICA
UAA, UGA, UAG = codoni di stop (non codificanti) RF = fattori di rilascio
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Accoppiamento trascrizione-traduzione (procarioti)
RNA + ribosomi DNA
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1 prodotto gene 2 o più prodotti operone
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operone: insieme di più sequenze codificanti controllate da un unico promotore
SD
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Regolazione dei geni batterici
a livello trascrizionale, con un controllo che può riguardare l’inizio della sintesi dell’mRNA o la terminazione precoce del processo a livello traduzionale, con meccanismi che riguardano principalmente la fase di inizio del processo
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geni regolati negativamente
REPRESSORE espressione inducibile sito operatore
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geni regolati negativamente
REPRESSORE espressione reprimibile
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geni regolati positivamente
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Esempio: l'operone lacZYA
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ENZIMI PER L’UTILIZZO DEL LATTOSIO
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espressione inducibile
(LATTOSIO = INDUTTORE)
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OPERONE LAC TRASCRITTO
RBS REPRESSORE (LacI) REPRESSORE INATTIVO INDUTTORE (lattosio) OPERONE LAC TRASCRITTO
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Crescita con glucosio e lattosio
La presenza del glucosio inibisce l’espressione dell’operone
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glucosio lacZYA non si esprime
glucosio + lattosio lacZYA si esprime a livelli molto bassi lattosio lacZYA si esprime a livelli alti la presenza di glucosio ha un effetto negativo sull'espressione di lacZYA + glucosio = bassi livelli intracellulari di cAMP - glucosio = alti livelli intracellulari di cAMP
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lacZYA necessita di un attivatore = proteina CAP (o CRP) legata al cAMP
RBS
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GLUCOSIO ASSENTE Il P destinato al glucosio attiva l’adenilato ciclasi (alti livelli di cAMP) CRP ATTIVO
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Trascrizione repressa
REPRESSORE INATTIVO (+lattosio) PROTEINA CAP REPRESSORE ATTIVO (-lattosio) AMP CICLICO RNA pol. -LATTOSIO: Repressore attivo Trascrizione repressa
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Trascrizione alta (utilizzo del lattosio) cAMP alti livelli
REPRESSORE INATTIVO (+lattosio) PROTEINA CAP REPRESSORE ATTIVO (-lattosio) AMP CICLICO RNA pol. +LATTOSIO -GLUCOSIO : Repressore inattivo Trascrizione alta (utilizzo del lattosio) cAMP alti livelli Proteina CAP attiva
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Trascrizione bassa (viene usato prima tutto il glucosio) cAMP basso
REPRESSORE INATTIVO (+lattosio) PROTEINA CAP REPRESSORE attivo (-lattosio) AMP CICLICO RNA pol. +LATTOSIO + GLUCOSIO Repressore inattivo Trascrizione bassa (viene usato prima tutto il glucosio) cAMP basso Proteina CAP inattiva
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P REPRESSORE INATTIVO (+lattosio) PROTEINA CAP REPRESSORE ATTIVO
AMP CICLICO RNA pol. - lattosio: REPRESSORE ATTIVO, NO TRASCRIZIONE + lattosio: REPRESSORE INATTIVO, SI TRASCRIZIONE +glucosio:NO AMPc, NO ATTIVATORE, TRASCRIZIONE BASSA (utilizzo preferenziale del glucosio) - glucosio: SI AMPc, SI ATTIVATORE, TRASCRIZIONE ALTA (utilizzo del lattosio) + Glucosio Glucosio-P P EIII Adenilato ciclasi cAMP - Glucosio
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