Lezione 4 Le costanti di accoppiamento Il rilassamento

Presentazione sul tema: "Lezione 4 Le costanti di accoppiamento Il rilassamento"— Transcript della presentazione:

1 Lezione 4 Le costanti di accoppiamento Il rilassamento
Accoppiamento dipolare

2 Accoppiamento dipolare
A differenza dell’accoppiamento scalare, l’accoppiamento dipolare altera la popolazione dei livelli del sistema e non i valori di energia Da un punto di vista fisico, é l’accoppiamento tra due “magneti” che sono vicino nello spazio

3 Accoppiamento dipolare
L’accoppiamento dipolare si ha tra due spin che sono vicini nello spazio Si tratta della interazione tra due dipoli magnetici, tra i quali, quando essi sono vicini nello spazio, si ha uno scambio di energia L’entità dell’effetto dipende dal campo magnetico e dalle dimensioni della molecola. Nel caso di spin 1H, l’accoppiamento dipolare si trasferisce per spin che si trovano a distanze inferiori ai 5 A. NON si osservano doppietti L’accoppiamento dipolare da luogo ad un trasferimento di magnetizzazione da uno spin all’altro. Questo effetto va sotto il nome di effetto NOE Nuclear Overhauser Effect Aumenta la intensità di B Perturbo A

4 Accoppiamento dipolare
L’accoppiamento dipolare è “indipendente dall’accoppiamento scalare 2 spin possono essere accoppiati : -Scalarmente E dipolarmente se sono vicini nello spazio e legati da legami chimici -scalarmente ma non dipolarmente se sono legati da legami chimici ma non vicini nello spazio -dipolarmente ma non scalarmente se sono spazialmente vicini ma non legati da legamei chimici L’effetto NOE è osservabile in un esperimento NMR bidimensionale , detto NOESY (in realtà si puo’ anche osservare in esperimenti monodimensionle (1D NOE) di cui pero’ non parleremo Pensate a degli esempi, per favore

5 Distance constraints mJ B0 mI q r
NOESY volumes are proportional to the sixth power of the interproton distance and to the correlation time for the dipolar coupling mJ B0 mI q r

6 Accoppiamento scalare ed accoppiamento dipolare
L’accoppiamento scalare è l’accoppiamento tra spin nucleari che avviene tra atomi che sono legati da legami chimici (THROUGH BOND) E’ l’accoppiamento tra spin determinato dagli orbitali molecolari, ovvero le energie dei livelli di spin nucleari sono interdipendenti Porta alla formazione di doppietti e multipletti. Puo’ essere sfruttato per trasferire magnetizzazione da uno spin ad un altro, sfruttando il trasferimento atraverso legami chimici L’accoppiamento dipolare è l’accoppiamento tra spin nucleari che avviene tra atomi che sono vicini nella spazio (THROUGH SPACE) E’ l’accoppiamento tra due dipoli magnetici che sono vicini tra di loro Puo’ essere sfruttato per trasferire magnetizzazione da uno spin ad un altro, in funzione della loro prossimità spaziale

7 Through space AND throuhg bonds
Through bond

8 1D experiment ..Too crowded.. Chemical shifts relaxation rates
Could be nice but... Not enough to get a structure What do we learn?

9 The need for multidimensional NMR

10 The need for multidimensional NMR

11 Cosa è un esperimento bidimensionale ?
Dopo un impulsi il segnale è pronto per essere acquisito Facciamo l’acquisizione ma NON terminiamo l’esperimento ed applichiamo ancora uno o piu’ impulsi in modo da perturbare ulterioremente il sistema Attraverso una combinazione di impulsi e delays noi facciamo in modo che ci sia uno scambio di magnetizzazione tra spin accoppiati SUCCESSIVAMENTE, acquisiamo il segnale una seconda volta

12 A 2D! An FID is a series of data points, each data point being separated by a sampling time (dwell time) F(t) A computer will consider an FID as a one dimensional array of data points.Each point has a different intensity 0, d,2 d,3 d,4 d …….…n d 3m 3m+d 3m+2 d 3m 3m+3d F(t2) F(t) 3m+ d 3m+2 d We will now repeat the experiment a second time, just changing another delay previous to acquisition. F(t1) We collect a second F(t) which will be identical but for such delay. We store it in this way. We repeat the same experiment n times We obtain a two dimensional array of data points in which rows and columns represent INDEPENDENT TIME DOMAINS. EACH POINT will be a function of both t1 and t2 The overall signal is an F(t1,t2) 3m+n d

13 Fourier transformation
F(t1,t2) Fourier transformation (t2) F(n1,t2) Fourier transformation (t1) F(t1,n2) F(n1,n2)

14 Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2)
Se la perturbazione non ha effetto e se non c’è trasferimento di alcun tipo, Io ottengo lo stesso spettro in ciascuna delle 2 dimensioni tempo (t1 e t2) Dopo la trasformate di Fourier io otterro’ uno spettro dove i segnali appaiono su una diagonale di una matrice quadrata

15 Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2)
Se durante la perturbazione una parte della magnetizzazione si traferisce da un nucleo ad un altro, per esempio per effetto di accoppiamento scalare, allora lo spettro della dimensione t2 sarà diverso da quello della dimensione t1. Il risultato è che avro’ dei segnali fuori dalla diagonale. Ciascun segnale fuori dalla diagonale darà la informazione sugli accoppiamenti scalari attivi nel sistema M (wI t1) (wSt2)

16 EXAMPLE O H H N C C We make a 1H experiment and we acquire. I observe Hn Then all signals transfer the information because of scalar coupling H H N C Spectrum before The J coupling Then I observe Hc I consider the first and the second acquisition as two indpendent dimensions Spectrum after The J coupling

17 EXAMPLE O H H N C C Signal! 9 ppm 4 ppm H H N C Spectrum before
This indicates that there is a scalar coupling between Hn and Hc H H N C Spectrum before The J coupling 9 ppm 4 ppm Spectrum after The J coupling

18 EXAMPLE O H H N C C Signal! 9 ppm 4 ppm Hn Hn Hc J-coupling H H N C
This indicates that there is a scalar coupling between Hn and Hc H H N C Spectrum before The J coupling 9 ppm 4 ppm Hn Hn Hc J-coupling Spectrum after The J coupling

19 EXAMPLE O H H N C C If you begin from Hc , the situation is the same !
Spectrum before The J coupling Hc Hc Hn J-coupling Spectrum after The J coupling

20 EXAMPLE O H H N C C Therefore, if I consider only this system Hc Hc Hn
Spectrum before The J coupling Hn J-coupling Hn Hn Hc J-coupling Spectrum after The J coupling

21 The second dimension = t2
The first dimension = t1 The second dimension = t2 the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE example t1 dimension Or F1 t1 t2 t2 dimension Or F2

22 Usually t1 is also defined as indirect dimension
t2 is also defined as direct dimension the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE example t1 dimension Or F1 t1 t2 t2 dimension Or F2

23 CROSS PEAK= Yes, There is a COUPLING between the two frequencies
Definitions Diagonal peak The same frequency is observed in both dimensions F1 Cross peak Two different frequencies are observed in the two dimensions F2 CROSS PEAK= Yes, There is a COUPLING between the two frequencies

24 Accoppiamento scalare
L’accoppiamento scalare puo’ comunque essere osservato attraverso esperimenti NMR bidimensionali, quali il COSY

25 COrrelation SpectroscopY
Example: COSY Through-bond connectivities H4’-H5’ H4-H5 COSY= COrrelation SpectroscopY

26 COrrelation SpectroscopY
Example: COSY Through-bond connectivities H4’-H5’ 2 4 3 H4-H5 5 6 COSY= COrrelation SpectroscopY 1

27 Beyond COSY COSY is not the only 2D experiment
It is possible to transfer the information from spin A to spin B via several possible mechanisms The most important routes, which is COMPLEMENTARY TO J-coupling Is THROUGH SPACE COUPLING

28 The “old times” approach
NOESY Identify through space connectivities HN(i)-Ha(i) and HN(i)Ha(i-1) Identify through bond connectivities HN(i)-Ha(i) COSY NOESY conn. COSY conn

29 Through space AND throuhg bonds
Through bond

30 Troppi segnali 1H ?

31 Isotope labeling For biomolecules, tipically, 15N or 13C and 15N, or 13C, 15N, 2H 15N Only A more effective fingerprint -characterization -folding -dynamics protein size >10000 Homonuclear 2D experiments do not have enough resolution HSQC or HMQC HSQC-NOESY or HSQC TOCSY

32 Isotope labeling For biomolecules, tipically, 15N or 13C and 15N, or 13C, 15N, 2H protein size >20000 15N and 13C Scalar couplings through 13C atoms -triple resonance -assignment -structure

33 1J couplings for backbone resonances

34 The HSQC experiment

35 Heteronuclear cases The scheme of 1J scalar couplings

36 Heteronuclear NMR OBSERVE 13C during t1
Transfer the information to all 1H coupled Observe 1H during t2 No more diagonal Each peak indicate A differen H-C pair 13C 1H

37 Heteronuclear NMR OBSERVE 13C during t1
Transfer the information to all 1H coupled Observe 1H during t2 No more diagonal CH2 Two protons are bound to the same carbon 13C 1H

38 The HSQC experiment

39 The HSQC experiment Detect H-N couplings
Each amide NH group gives rise to one peak Same sensitivity of a 1H experiment (although you are observing 15N) but much larger resolution In 5 minutes you may know…. if your protein is properly folded if all aminoacids gives rise to an observable peak if you can do the job (whatever is your job)

40 STRUTTURE IN SOLUZIONE VIA NMR

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56 Solution structure of oxidized and reduced Cytochrome c
Cyt c oxidized Cyt c reduced Banci, Bertini, Bren, Gray, Sompornpisut, Turano, Biochemistry, 1997 Baistrocchi, Banci, Bertini, Turano, Bren, Gray, Biochemistry, 1996

57 Active site channel of Reduced Monomeric Q133 Copper Zinc Superoxide dismutase
 Reduced Q133M2SOD  Oxidized human SOD

58 Structure of Ce3+ substituted Calbindin D9k
20 40 60 80 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 Paramagnetic structure Diamagnetic structure RMSD backbone Residue Number risultato Bertini, Donaire, Jiménez, Luchinat, Parigi, Piccioli, Poggi, J.Biomol. NMR, 2001,21,85-98

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60 The HSQC experiment Detect H-N couplings
Each amide NH group gives rise to one peak Same sensitivity of a 1H experiment (although you are observing 15N) but much larger resolution In 5 minutes you may know…. if your protein is properly folded if all aminoacids gives rise to an observable peak if you can do the job (whatever is your job)

61 Screening in silico + NMR
Identificazioni dei siti di interazione: Analisi delle superfici in silico Analisi delle superfici via NMR (HSQC)

62 15N HSQC del CytC con Cloroamina T
ppm ppm

63 The role of metal cofactor in protein unfolding
Metal triggered protein folding Apo 3.3 M GdmCl 3.3 M GdmCl Ca2+ Loss of secondary structure elements: unfolded protein Refolding

64 Structure-Activity Relationship by NMR

65 Dall’analisi risultano interagire 12 composti
Screening via NMR Libreria di ProtEra 14 serie da 26 composti Proteina standard CytC da lievito Via Water LOGSY è stata analizzata l’interazione del CytC con 3 serie di composti (78) Dall’analisi risultano interagire 12 composti NMR time per inibitore: 45’x 2 Conc. del CytC non marcato: 8 mM Conc. dell’inibitore: 800 mM

66 Water LOGSY del CytC con Cloroamina T
700MHz 303K