Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)

Presentazione sul tema: "Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)"— Transcript della presentazione:

1 Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)
Test diagnostici di Laboratorio Valeria Ghisetti e Giovanna Marchiaro S.C. Microbiologia ASO San Giovanni Battista - Molinette

2 WHO”global allert” Inizio anni ’80 AIDS Inizio 2003 SARS 2 anni per
identificare HIV 4 settimane per SARS-CoV 2 settimane per identificare il virus 2 settimane per sequenziare il genoma e stabilire la filogenesi di SARS-CoV

3 WHO Regional & Country Offices
WHO”global allert” marzo 2003 WHO National Disease Control Centres WHO Regional & Country Offices UN & CDC Electronic Discussions Invio di materiali biologici sangue,siero escreato tamponi faringei e nasofaringei materiale autoptico Media 13 laboratori di riferimento in 10 paesi (richiesto BSL 3) NHI mobilita 300 ricercatori del CDC

4 SARS-CoV: agente eziologico di SARS
Ordine: Nidovirales Famiglia: Coronaviridae Genere: Coronavirus Species : SARS-CoV Virus “giganti” : Il genoma consta di ~ nt HIV ~ nt, HBV ~ nt Virus ad RNA+ (RNA: mRNA) Alta variabilità genetica “corona”: proteina S legante il recettore e epitopi neutralizzanti

5 SARS-CoV Gruppo I Gruppo III Gruppo II
Virus della gastroenterite suina Coronavirus umano229E Coronavirus della peritonite del gatto Coronavirus del cane Gruppo III Virus della bronchite degli uccelli Coronavirus dei tacchini SARS-CoV Gruppo II Virus dell’epatite dei topi Virus della sialoadenite dei ratti Virus dell’encefalite suina Coronavirus umano OC43 Coronavirus dei bovini

6 SARS : criteri di diagnosi
Criteri clinici Criteri epidemiologici Criteri di laboratorio conferma diagnosi di SARS esclusione diagnosi di SARS CDC, MMWR, 2003, 52

7 Criteri di laboratorio per definire l’infezione da SARS-CoV
Diagnosi di SARS confermata Isolamento in coltura di SARS-CoV Identificazione del genoma di SARS-CoV mediante test molecolare di RT-PCR (validato da OMS e CDC) Presenza di anticorpi anti-SARS-CoV nella fase acuta o dopo 21 giorni dall’esordio (test sierologici validati da OMS e CDC) Diagnosi di esclusione di SARS Diagnosi alternativa (altro agente patogeno) che spieghi il quadro clinico Assenza di anticorpi anti-SARS-CoV nel siero prelevato nella fase di convalescenza (>21 giorni dall’esordio) CDC, MMWR, 2003, 52

8 Identificazione di SARS-CoV
Materiali Biologici Diagnosi rapida Analisi molecolari Risultati in <1 giorno Isolamento in colture cellulari Effetto citopatico Vero E6 Giorni 3-5 Microscopia elettronica Virioni tipo Coronavirus Risultati in piu’ giorni Identificazione con pool di anticorpi policlonali per Coronavirus (35-40 antisieri) Drosten,et al. NEJM, 2003; 348, 20 Ksiazek et al. NEJM, 2003, 348:20

9 Polymerase Chain Reaction (PCR)
DNA denaturation Primers annealing & extention Amplification Sequence to be amplified Taq n cicl.... Numero di cicli 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 20 30 Numero di molecole ottenute 16 32 64 128 256 512 1.024 Y= x2n Y= numero molecole di DNA amplificato x= numero molecole di DNA di partenza n= numero dei cicli di PCR Risultati in <1 giorno

10 Real time PCR 6 ore cycles Quantizzazione SARS-CoV
Sensibilità 1-10 copie 6 ore

11 secondo validazione OMS e CDC
Diagnosi rapida di SARS-CoV S.C. Microbiologia, ASO San Giovanni Battista - Molinette Real-Time RT-PCR secondo validazione OMS e CDC Estrazione RNA Retrotrascrizione RNA-cDNA Real time PCR multiplex controllo interno di competenza DNA 6 ore

12 Identificazione di SARS-CoV sensibilità clinica dei test
Pazienti con campioni positivi/pazienti totali affetti da SARS RT-PCR Isolamento in coltura Sierologia 15/17* 5/17 7/17 *i due casi RT-PCR negativi (tamponi orofaringei) presentavano anticorpi specifici contro SARS-CoV Campioni: Lavaggio orofaringeo (n=13) Tampone nasale (n=5) Bal (n=1) Escreato (n=2) Aspirato midollare (n=1) Biopsia polmonare (n=2) Biopsia renale (n=1) Ksiazek et al. NEJM, 2003, 348:20

13 Analisi molecolare di SARS-CoV
Criteri di validazione del test di PCR Test ripetutamente positivo (almeno 2 volte) sullo stesso campione Test positivo su due campioni differenti es. tampone nasofaringeo e feci/sangue Test positivo su due campioni provenienti dallo stesso sito ma raccolti a distanza di 1-2 giorni CDC, MMWR, 2003, 52

14 Campioni biologici per i test di laboratorio in caso di sospetta SARS
Materiali provenienti dalle vie respiratorie superiori Lavaggi/aspirati naso e orofaringei Tamponi naso-faringei e oro-faringei Escreato Materiali provenienti dalle vie respiratorie inferiori Lavaggio bronco-alveolare Broncoaspirato e aspirato tracheale Liquido pleurico Sangue Sangue intero Siero per dosaggio anticorpale Due prelievi : uno in fase acuta e uno nella fase di convalescenza (>21 giorni dall’esordio) CDC, MMWR, 2003, 52

15 Carica virale di SARS-CoV nei diversi materiali: studio di un caso indice
Materiale Giorno dall’esordio RT-PCR nested Real-time PCR Carica virale/ml Surnatante colture + 8.3x106 Escreato +9 +3 108 6x104 Tampone orofaringeo - <800 Tampone nasofaringeo Plasma 190 BAL +11 4x105 Feci +19 +25 ND Drosten,et al. NEJM, 2003, 348:20

16 Agenti di bioterrorismo
Riconoscimento dell’eziologia di SARS Esclusione dei patogeni respiratori e di altri patogeni che possono interessare le basse vie respiratorie Agenti di bioterrorismo Yersinia Mycoplasma Chlamydia Legionella Coxiella burneti Rickettsiae Virus dell’influenza A e B Paramyxoviridae RSV e metapneumovirus Mastadenoviridae Herpetoviridae Hantavirus Picornaviridae Arenavirus Metodiche tradizionali Colture microbiologiche Colture cellulari Indagini sierologiche Inoculazione in topi Microscopia elettronica BSL 3 Metodiche molecolari Drosten,et al. NEJM, 2003; 348, 20, Ksiazek et al. NEJM, 2003, 348:20

17 Test sierologici per SARS-CoV caratteristiche e limiti
SARS-CoV non ha mai circolato nell’uomo Anticorpi positivi a +10 giorni dall’infezione crescita lenta Un singolo test positivo e’ indicativo di infezione acuta/recente richiesto il dosaggio delle IgM e/o la valutazione dell’incremento (almeno 4 volte) del titolo anticorpale Un test negativo non esclude SARS Esclusione di SARS : assenza di anticorpi specifici in siero convalescente (>21 giorni dopo l’insorgenza della malattia) IFA disponibile commercialmente per Ab totali CDC, MMWR, 2003, 52

18 SARS: aspetti organizzativi del Laboratorio
BSL 3 per manipolazione dei campioni Personale specializzato e addestrato ad hoc biologi e tecnici molecolari Turni di pronta disponibilità specifica

19 Variabilità genetica di SARS-CoV
Da dove viene SARS-CoV ? Ibrido da fenomeni di ricombinazione genetica che occorrono naturalmente 10% di fenomeni di ricombinazione genetica nello stesso virus animali coinfettati da due Coronavirus producono una progenie per il 50% costituita da ricombinanti colture cellulari : ceppi ricombinanti ogni 5 milioni di cellule infettate o transfettate Salto di specie da animale a uomo Coronavirus animale che ha trovato nell’uomo un ambiente favorevole (assenza di immunita’) Di che animale si tratta??

20 Analisi molecolare delle varianti virali
1-Analisi delle sequenze nucleotidiche Confronto sequenze nucleotidiche e aminoacidiche dei diversi gruppi di Coronavirus similitudine di SARS-CoV: (nt) e (aa) SARS-CoV e’ un Coronavirus diverso da quelli noti Albero filogenetico di SARS-CoV

21 2- Microarray & Microchips
Analisi molecolare delle varianti virali 2- Microarray & Microchips Due tipi di disegno : sonde specifiche per ogni possibile variante di un gene es.gene POL per mutazioni di RT di HIV sonde specifiche per ogni singola variante virale es. sonde specifiche per i diversi Coronavirus Enormi potenzialità nell’identificare nuovi agenti patogeni (Bioterrorismo) e nuove varianti virali farmacoresistenti (HIV e Micobatteri) Costi molto elevati.....

22 Scenario Individuo suscettibile Biologia Molecolare RNA/DNA
Migliore comprensione della biologia virale Individuo suscettibile Migliori strategie per la diagnosi e il controllo delle infezioni virali Tecniche di manipolazione genetica Nuovi vaccini Salto di specie? HIV 1 e 2 Il virus Hendra Il virus Nipah Il virus dell’influenza A H5N1 SARS-CoV? Bioterrorismo? Biologia Molecolare