Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)

Presentazione sul tema: "Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)"— Transcript della presentazione:

1 Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)
Applicabile a: amminoacidi proteine acidi nucleici idrocarburi carboidrati prodotti farmaceutici pesticidi antibiotici steroidi HPLC Lab. Chimica Analitica II _

2 Efficienza della colonna in HPLC
Effetto della dimensione delle particelle e del flusso sull’altezza H del piatto teorico Dimensioni colonna: 30 x 2.4 mm Soluto: N,N-dietil-n-aminoazobenzene Fase mobile: esano, CH2Cl2, isopropanolo Effetto della dimensione del campione sull’altezza H del piatto teorico HPLC Lab. Chimica Analitica II _

3 Schema di un'apparecchiatura per HPLC
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4 Sistemi di pompaggio del solvente
Requisiti: Pressioni fino a 430 atm Uscita priva di pulsazioni vflusso da 0.1 a 10 ml/min componenti resistenti alla corrosione controllo di flusso ad alta riproducibilità Tipi di pompe utilizzati: alternative a pistone o diaframma a siringa o a spostamento pneumatiche o a pressione costante HPLC Lab. Chimica Analitica II _

5 Pompa alternativa a pistone singolo Pompa alternativa a pistone doppio
HPLC Lab. Chimica Analitica II _

6 Sistemi di iniezione Problematiche::
Accuratezza e precisione dipendenti dalla siringa Difficilmente applicabili ad automazione HPLC Lab. Chimica Analitica II _

7 Rivelatori Caratteristiche del rivelatore ideale: Sensibilità adeguata
Buona stabilità e riproducibilità Risposta lineare in un ampio intervallo Tempo di risposta breve Elevata affidabilità e facilità d’uso Fattore di risposta uniforme o sensibilità specifica Metodo di rivelazione non distruttivo Volume interno minimo per ridurre l’allargamento di banda Tipi di rivelatori: proprietà di massa: indice di rifrazione, costante dielettrica, densità proprietà del soluto: assorbanza UV-Vis, fluorescenza, corrente di diffusione HPLC Lab. Chimica Analitica II _

8 Rivelatori più diffusi:
HPLC Lab. Chimica Analitica II _

9 Rivelatori ad assorbanza
Cella di flusso a Z: V = 1 – 10 l l = 2 – 10 mm pmax = 40 atm Rivelatori UV a filtro noti anche come rivelatori a lunghezza d’onda fissa utilizzano una lampada Hg a bassa pressione basso livello di rumore (2 x 10-5 AU) non sensibile a variazioni di temperatura, flusso, composizione della fase mobile Lungo tempo di vita della lampada (> 1 anno)  fissa: 254, 250, 313, 334, 365 nm HPLC Lab. Chimica Analitica II _

10 Rivelatori UV a monocromatore
spettrofotometro a scansione con reticoli a diffrazione possibilità di registrare un cromatogramma a  fissa o a  diverse per ogni picco possibilità di utilizzo di rivelatori diode array possibilità di ottenere diagrammi 3D Spettri di assorbimento dell’eluito di una miscela di tre steroidi, acquisiti ad intervalli di 5 secondi HPLC Lab. Chimica Analitica II _

11 Rivelatori a fluorescenza
Rivelatori IR rivelatori a tre filtri a cuneo semicircolari  – 690 cm-1 rivelatori FT-IR l = 0.2 – 1 mm, V = 1.5 – 10 l Rivelatori a fluorescenza utilizzano rivelatori fotoelettrici a 90° rispetto al raggio d’eccitazione Sorgente a Hg o Xe, filtri o monocromatori a reticolo per isolare la radiazione elevata sensibilità possibilità di incrementare la fluorescenza mediante trattamento preliminare dei campioni (es. 5-dimetilaminonaftalen-1-solfonil cloruro = cloruro di dansile) Possono avere limiti di linearità inferiori ai rivelatori di assorbanza (0.1 AU) HPLC Lab. Chimica Analitica II _

12 Rivelatori ad indice di rifrazione
Possono rivelare la maggior parte dei soluti, purché RI del soluto sia diverso da quello della fase mobile Sensibili alla temperatura, non al flusso Sensibilità inferiore agli altri rivelatori Non applicabili all’eluizione in gradiente Utili su scala preparativa HPLC Lab. Chimica Analitica II _

13 Rivelatori elettrochimici
Basati su: amperometria, coulombometria, voltammetria, conduttimetria Elettrodo in Pt, Au, grafite vetrosa o pasta di grafite V = 1 – 5 l Applicabile alla determinazione di disolfuri e tioli HPLC Lab. Chimica Analitica II _

14 Rivelatori compositi Rivelatori a spettrometria di massa
Rivelatori NMR HPLC Lab. Chimica Analitica II _

15 Fase stazionaria in HPLC
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16 Cromatogramma di eluizione LSC
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17 HPLC Lab. Chimica Analitica II _

18 Processi di silanizzazione
Possibili gruppi funzionali sulla superficie della silice Reazioni di silanizzazione per la produzione di fasi legate HPLC Lab. Chimica Analitica II _

19 Cromatografia in fase normale e inversa
Effetto della lunghezza di catena sulle prestazioni di una colonna di silossano in fase inversa riempita con particelle di 5 m. MeOH: H2O = 50%, 1ml/min HPLC Lab. Chimica Analitica II _

20 HPLC Lab. Chimica Analitica II _

21 Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)
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