Perché conoscere i metodi strutturali?

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1 Perché conoscere i metodi strutturali?

2 From genome to structure. From structure to function
....acccaa gaagtcagaa tcctcgaagc tgaagcctga ctgtaagctc tgcctcctac aactagacaa gtcacaatgc aacccctttg ctccagagga aaaggagtaa gcacagaggg cttctgagtc cggcaatgct ccatttcctg acaggagcat tttacagact tgcgtctgcc cctctgaggg ... From: Prof. Anna Tramontano

3 Biomolecular Structures

4 New folds per year

5 NMR vs XRay

6 Molecule type Protein DNA RNA Protein-DNA complexes 1200 55000 750
2500 RNA Protein-DNA complexes

7 Strumenti per la Biologia strutturale
Structural Tools

8 The Nobel Prize in Physics 1943
"for his contribution to the development of the molecular ray method and his discovery of the magnetic moment of the proton" Otto Stern The Nobel Prize in Physics 1944 "for his resonance method for recording the magnetic properties of atomic nuclei" Isidor Isaac Rabi The Nobel Prize in Physics 1952 "for their development of new methods for nuclear magnetic precision measurements and discoveries in connection therewith” Felix Bloch Edward Mills Purcell

9 The Nobel Prize in Chemistry 1991
"for his contributions to the development of the methodology of high resolution nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy" Richard R. Ernst The Nobel Prize in Chemistry 2002 "for his development of nuclear magnetic resonance spectroscopy for determining the three-dimensional structure of biological macromolecules in solution” Kurt Wüthrich /2 of the prize

10 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2003
"for their discoveries concerning magnetic resonance imaging” Paul C. Lauterbur Sir Peter Mansfield The Nobel Prize in Physics 2003 ”for pioneering contributions to the theory of superconductors” Alexei A. Abrikosov Vitaly L. Ginzburg 1/3 of the prize /3 of the prize

11 Che cosa è uno spin

12 Che cosa è un momento angolare
Il momento angolare o momento della quantità di moto o impulso angolare di un corpo rotante rispetto al centro attorno al quale gira (detto anche polo) è un'importante grandezza che caratterizza il moto circolare. Fisicamente è Il momento angolare è definito come il prodotto vettoriale tra il vettore posizione (rispetto alla stessa origine) e il vettore quantità di moto:L=r X mv Il modulo di è quindi definito da: L=rmv sinq. La direzione di è perpendicolare al piano definito da r e da mv ; il verso è quello di un osservatore che vede ruotare in senso antiorario.

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14 Che cosa è un momento angolare di spin
Lo SPIN è una forma di momento angolare. A differenza del momento angolare classico, esso NON è prodotto dalla rotazione di un oggetto intorno ad un asse ma è una intrinseca proprietà dell’oggetto studiato. Relazione tra spin e momento angolare di spin S= [S(S+1)]½ h/2p

15 Spin e momento angolare di spin
Ad una particella, dotata di spin S (dove S ha tipicamente valore ½) è associato un momento angolare di spin dato da [S(S+1)]½ h/2p Dove h/2p è una costante di proporzionalità chiamata costante di Planck h/2p= 1,054x10-34 Js-1 = ħ

16 Che cosa è un momento magnetico
Il momento magnetico è un VETTORE che misura la capacità di un oggetto di interagire con i campi magnetici Minima energia quando il momento magnetico ed il campo magnetico sono paralleli E= -mB cosq bussola Il Magnetismo si occupa si studiare le proprietà magnetiche delle sostanze, ovvero da che cosa dipende il momento magnetico m di una sostanza

17 Che cosa è un momento magnetico di spin
Ad ogni momento angolare di spin viene associato un momento magnetico di spin Figure 2.5 Levitt La costante di proporzionalità tra il vettore momento angolare ed il vetore momento magnetico è detta RAPPORTO GIROMAGNETICO m= -gS Il rapporto giromangetico è una proprietà intrinseca di ogni particella

18 Che cosa è un momento magnetico di spin
SPIN S=1/2 S= [S(S+1)]½ h/2p Momento angolare di spin Momento magnetico di spin m= -gS

19 Che cosa è un momento magnetico di spin
Ogni spin quindi si comporta come un piccolo ago di una bussola. Quando viene immerso in un campo magnetico, lui tende ad orientarsi lungo il campo magnetico in modo da assumere il minimo di energia E= -mB cosq = -gS cosq m B q

20 Quantizzazione Il concetto di spin è associato alla meccanica quantistica, ovvero alla fisica che descrive il comportamento dei sistemi con particelle “infinitamente piccole” ovvero non trattabili con le regole della fisica classica. In accordo alla meccanica quantistica, l’energia della interazione tra il momento magnetico di spin ed il campo magnetico non puo’ essere “qualsiasi”, ma puo’ assumere solo valori definiti NO

21 Quantizzazione Il concetto di spin è associato alla meccanica quantistica, ovvero alla fisica che descrive il comportamento dei sistemi con particelle “infinitamente piccole” ovvero non trattabili con le regole della fisica classica. In accordo alla meccanica quantistica, l’energia della interazione tra il momento magnetico di spin ed il campo magnetico non puo’ essere “qualsiasi”, ma puo’ assumere solo valori definiti E= -mB cosq = -g[S(S+1)]1/2 ħ B cosq E= = -g ħ m B m=+1/2 , -1/2

22 Quantizzazione E= +1/2 ħ g B E= -1/2 ħ g B
Quindi, quando uno particella con uno spin S=1/2 è immersa in un campo magnetico, ci sono solo due valori di Energia possibili (permessi) E= +1/2 ħ g B E= -1/2 ħ g B E= -mB cosq = -g[S(S+1)]1/2 ħ B cosq E= = - ħ g m B m=+1/2 , -1/2

23 Che cosa è una onda

24 Lunghezza d’onda l = tratto corrispondente all’intero ciclo di valori
Frequenza n = numero di volte per secondo in cui il vettore assume l’intero ciclo di valori n (Hz) = c (m s-1)/ l (m)

25 Diffrazione della luce visibile da parte di un prisma e spettro della luce.

26 Spettro delle radiazioni elettromagnetiche
by Andreas Kamlowski

27 Relazione fra energia e frequenza
E = hn h = costante di Plank 6.62 x J s E

28 Adesso cominciamo

29 Come è fatto un nucleo Isotopi, Isotopomeri Tabella periodica

30 Nota bene Un momento angolare di spin si indica generalmente con la lettera S Molto spesso quando si trattano argomenti di questo tipo, si usano due lettere distinte per distinguere uno momento angolare o un numero quantico di spin elettronico da uno di spin nucleare S I

31 Ripasso.Nuclidi X A Z Un nuclide è un atomo caratterizzato dal numero atomico Z (numero di protoni) e dal numero di massa A (numero di neutroni e di protoni). Il nuclide neutro ha un numero di elettroni uguale a quello di protoni. Il numero Z caratterizza la specie atomica. H 1 C 12 6 O 16 8

32 Proprietà magnetiche delle particelle subatomiche
Ogni protone ed ogni neutrone possiede un numero quantico di spin I= +-1/2, in analogia alla situazione che voi già conoscete per gli elettroni. Ad ogni nucleo sarà associato un numero quantico di spin nucleare che è la somma di tutti i numeri di spin dei nucleoni. Analogamente agli elettroni, i nucleoni tendono ad “appaiare” lo spin. Tutti gli isotopi con un numero dispari di PROTONI O DI NEUTRONI nucleoni hanno un numero quantico di spin I≠0. Per i nucleoni piu’ pesanti, la regola di “massimo appaiamento” non è sempre verificata, per cui alcuni isotopi hanno numero quantico di spin >1/2. Alcuni nucleoni con numero di massa pari possiede I=1,2,3.. Mentre alcuni isotopi con numero di nucleoni dispari possiede I=3/2, 5/2, 7/2..

33 Livelli Energetici di spin nucleare

34 Spin nucelare e nuclidi
Protoni Neutroni I pari pari 0 dispari dispari 1,2,3 dispari pari ½,3/2, 5/2, 7/2 pari dispari ½,3/2, 5/2, 7/2

35 NMR-active nuclei with different spin numbers

36 Ovvero possono essere studiati via NMR
Nuclei NMR-attivi Tutti i nuclidi con un numero quantico di spin nucleare I diverso da zero sono NMR attivi, Ovvero possono essere studiati via NMR Per i piu’ comuni studi NMR vengono utilizati solo quei nuclidi con spin nucleare I=1/2

37 NMR-active nuclei with different spin numbers
11H, 21H, 42He, 126C, 136C, 147N, 157N, 168O, 178O, 199F, 2311Na, 2713Al 3115P, 3517Cl, 5426Fe

38 NMR-active nuclei with different spin numbers
42He, 126C, 168O, 5426Fe 11H, 136C, 157N, 178O, 199F, 2311Na, 2713Al 3115P, 3517Cl, 21H, 147N,

39 NMR-active nuclei with different spin numbers
I=1/ H, 136C, 3115P, 199F, 157N I=3/ Na 3517Cl I=5/ O 2713Al

40 Fine Lezione 1 15/03/2010

41 Isotopi Nuclidi con lo stesso Z ma differente A possono esistere e si chiamano isotopi. Una stessa specie atomica ha, di norma, diversi isotopi: si parla di miscela isotopica naturale. C 12 6 C 13 6 C 14 6

42 NMR e tabella periodica
Su questa base, quasi tutti gli elementi avranno almeno 1 isotopo NMR attivo C 12 6 C 13 6 C 14 6 98,9 % 1,11 % tracce

43 Isotopi naturali di alcuni elementi
Nuclide Massa relativa % di nuclidi 1H 1,007825 99,985 2H 2,014102 0,015 3He 3,016030 ~ 10-4 4He 4,002604 ~ 100 6Li 6,015126 7,42 7Li 7,01605 92,58 9Be 9,012186 10Be 10,013535 tracce 10B 10,012939 19,6 11B 11,009305 80,4 11C 11,011433 12C 12, 98,89 13C 13,003354 1,11 14C 14,003142

44 Alcuni Isotopi e loro proprietà

45 Alcuni Isotopi e loro proprietà

46 Alcuni Isotopi e loro proprietà

47 Alcuni Isotopi e loro proprietà

48 Momento Magnetico B0 m m=gI m
Ad un momento angolare di spin I è sempre associato un momento magnetico di spin m m B0 m=gI m Un momento magnetico può essere considerato come una piccola calamita. Come tale, se immersa in un campo magnetico, essa puo’ orientarsi in modo parallelo o antiparallelo al campo magnetico applicato esterno.

49 Momento Magnetico B0 m m=gI m
Ad un momento angolare di spin I è sempre associato un momento magnetico di spin m m B0 m=gI m Il rapporto giromagnetico g è una costante di proporzionalità tra il numero quantico di spin ed il momento magnetico. In pratica, due nuclidi con stesso valore di I (es: 11H e 136C) hanno un diverso momento magnetico perché ogni nuclide ha un proprio valore di g.

50 Rapporto giromagnetico
E= = - ħ g m B DE= = ħ g B La separazione in energia dipende dal valore del rapporto giromagnetico

51 L’energia della transizione NMR
B0 Il campo magnetico B0 serve per creare la separazione di energia tra i 2 livelli I due livelli energetici sono degeneri se B0=0

52 L’energia della transizione NMR
B0 Il campo magnetico B0 serve per creare la separazione di energia tra i 2 livelli I due livelli energetici sono degeneri se B0=0

53 Come si distribuiscono gli spin nei vari livelli energetici?

54 Statistica di Boltzmann
N up - N low N up = DE/2kT ca = e -DE/kT N up + N low N low La differenza di popolazione dipende dalla differenza di energia tra i due livelli La differenza di popolazione tra il livello fondamentale ed il livello eccitato è molto piccola D- Me ne importa qualcosa? R- ECCOME! La differenza di popolazione determina il numero di spin che effettivamente prendono parte alla transizione

55 Magnetizzazione osservabile

56 Magnetizzazione osservabile

57 Magnetizzazione osservabile

58 Fine lezione 2 marzo

59 Rapporto giromagnetico
E= = - ħ g m B DE= = ħ g B La separazione in energia dipende dal valore del rapporto giromagnetico

60 Magnetizzazione osservabile

61 Momento Magnetico m=+1/2 m=-1/2 E=+1/2ħg B E=-1/2ħg B

62 Momento Magnetico Il momento magnetico non è un oggetto statico, ma puo’ essere descritto come una trottola, che possiede una certa velocità angolare , tipica di ogni spin

63 Momento Magnetico E=-m •B0
L’energia di ogni spin è data, in termini fisici, dal prodotto scalare tra il campo magnetico applicato B0 ed il momento magnetico della particella m

64 Momento Magnetico E=-mħg B
Questo prodotto scalare dipende dall’orientazione del momento magnetico rispetto a B0. Per effetto delle regole di quantizzazione dell’energia, esso dipende dal numero quantico di spin nucleare m, che puo’ essere +1/2 oppure -1/2

65 Momento Magnetico E=-mħg B
Questo prodotto scalare dipende dall’orientazione del momento magnetico rispetto a B0. Per effetto delle regole di quantizzazione dell’energia, esso dipende dal numero quantico di spin nucleare m, che puo’ essere +1/2 oppure -1/2

66 Momento Magnetico m=+1/2 m=-1/2 E=+1/2ħg B E=-1/2ħg B

67 Momento Magnetico E=+1/2ħg B E=-1/2ħg B m=+1/2 m=-1/2 Stato eccitato
Meno popolato Stato fondamentale Più popolato

68 La frequenza di precessione di Larmor
Ogni momento magnetico precede intorno al campo magnetico statico B0 Spin equivalenti precedono tutti con la stessa velocità w0 anche se ciascuno con una fase diversa a: m = +½ ma = +½g Ea = -½gB0 B0 E = -mB0 E = -gmB0 equivalenti significa nuclidi di atomi identici b: m = -½ mb = -½g Eb = +½gB0 CH3CH2OH

69 La frequenza di precessione di Larmor
Poiche il numero dei momenti magnetici allineati con il campo magnetico é leggermente maggiore di quelli anti allineati la risultante é un vettore magnetizzazione M allineato lungo l’asse z a: m = +½ ma = +½g Ea = -½gB0 B0 M0 M0 = Sm = Mz Mx = My = 0 E = -mB0 E = -gmB0 La differenza tra le due popolazioni é tanto maggiore quanto piu’ elevata e la differenza di energia tra i due livelli b: m = -½ mb = -½g Eb = +½gB0

70 La frequenza di precessione di Larmor
La differenza di energia,(Eb-Ea), dipende dal tipo di nucleo (ogni nuclide a un diverso valore di g) e dal campo magnetico applicato a: m = +½ ma = +½g Ea = -½gB0 B0 E = -mB0 E = -gmB0 DE = gB0 = w0 = hn0 La differenza di energia é anche legata alla frequenza di precessione, ovvero alla velocità angolare con cui tutti I nuclidi equivalenti ruotano intorno a B0 b: m = -½ mb = -½g Eb = +½gB0

71 Il rapporto giromagnetico
mz=gIz =g(h/2p)mz Non tutti gli isotopi con I=1/2 hanno le stesse proprietà magnetiche Il momento magnetico è diverso per ogni isotopo e dipende dalla costante g DE=g(h/2p)B0 Tanto maggiore è g, tanto piu’ alta sarà la differenza di energia tra i 2 livelli della transizione NMR. Ovvero tanto maggiore sarà la sensibilità dell’esperimento

72

73 Effetto di un campo magnetico su uno spin nucleare
Mo

74 Effetto di un campo magnetico su uno spin nucleare
E= - m•B bussola E= - mħgB quantizzazione E2- E1 =DE= - ħgB= hn n= gB/2p Frequenza di risonanza di uno spin nucleare

75 Effetto di un campo magnetico su uno spin nucleare
Se non applico un campo magnetico esterno non succede nulla Quando gli spin nucleare sono immersi in un cmpo magnetico, Ciascun spin assume una propria frequenza di risonanza che è tanto piu’ alta quanto maggiore è il campo magnetico applicato

76 Frequenze di risonanza

77 LEZIONE 2

78 Different Isotopes Absorb at Different Frequencies
2H 13C 31P 19F 1H 50 MHz MHz MHz MHz MHz MHz low frequency high frequency

79 Rapporto giromagnetico
E= = - ħ g m B DE= = ħ g B La separazione in energia dipende dal valore del rapporto giromagnetico

80 I parametri NMR Il chemical shift Le costanti di accoppiamento
La intensità dei segnali

81 Frequenza di precessione
n0 = - g B0 /2π Se cosi fosse, ogni nucleo attivo entrerebbe in risonanza con il campo esterno alla sua frequenza e tutti gli isotopi uguali si comporterebbero allo stesso modo (un unico segnale). La frequenza di precessione di un determinato nucleo ad un determinato campo magnetico è detta FREQUENZA DI PRECESSIONE DI LARMOR Es: al campo magnetico di 11.7 T, La FREQUENZA DI PRECESSIONE DI LARMOR del nuclide 1H è 500 MHz.

82 La costante di schermo

83 n= g/2p B0 (1-s) s = Costante di schermo Costante di schermo
Dipende dall’intorno elettronico

84 Chemical shift (n-nref/nref)*106 = d (ppm) Es: w1= 500.131 MHz
w1-w0= Hz = 1000/500.13x106 (ppm)= 2.0

85 Campi magnetici elevati determinano un aumento della risoluzione e della sensibilità

86 Chemical shift

87 Spettro 1H NMR di Vanillina

88 750 MHz 1H NMR Spettro di Tyrosine Kinase

89 1H NMR Spettro di vari solventi

90 13C NMR del Fullerene (C60)

91 Typical 1H NMR Spectrum Absorbance

92 Spettro 1H NMR di Citocromo c

93 TMS (Tetramethylsilane)
chemical shift d d = 0

94 Fattori che influenzano il chemical shift
Caratteristiche funzionali Effetti attraverso lo spazio Effetti paramagnetici

95 Perché ogni spin 1H ha una frequenza diversa?
Beff= (1-s)B0 CH3Cl CH3Br

96 Effetti induttivi

97 Effetto della Sostituzione sul Chemical Shift
CHCl3 CH2Cl2 CH3Cl ppm -CH2-Br CH2-CH2Br -CH2-CH2CH2Br ppm

98 Effetti Mesomeri

99 Competizione tra effetto mesomero ed effetto induttivo

100 Fattori che influenzano il chemical shift
Caratteristiche funzionali Effetti attraverso lo spazio Effetti paramagnetici

101 Anisotropia di schermo indotta dai legami chimici

102 Correnti d’anello

103 0.42

104 Some paradigmatic examples

105 NMR in macromolecole biologiche

106

107

108 NMR in macromolecole biologiche

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111 Simple shielding effects--electronegativity
The amount of shielding the nucleus experiences will vary with the density of the surrounding electron cloud If a 1H nucleus is bound to a more electronegative atom e.g. N or O as opposed to C, the density of the electron cloud will be lower and it will be less shielded or “deshielded”. These considerations extend beyond what is directly bonded to the H atom as well. N more electron withdrawing-- less shielded C less electron withdrawing-- more shielded H H

112 Simple shielding effects--electronegativity
less shielded higher resonance frequency more shielded lower resonance frequency aliphatic/alpha/beta etc.(HC) amides (HN) most HN nuclei come between 6-11 ppm while most HC nuclei come between -1 and 6 ppm.

113 More complex shielding effects: Aromatic protons
aromatic region (6-8 ppm) amide region (7-10 ppm) One consequence of these effects is that aromatic protons, which are attached to aromatic rings, are deshielded relative to other HC protons. In fact, aromatic ring protons overlap with the amide (HN) region.

114 It should now be apparent to you that different types of proton in
a protein will resonate at different frequencies based on simple chemical considerations. For instance, Ha protons will resonate in a region centered around the relatively high shift of 4.4 ppm, based on the fact that they are adjacent to a carbonyl and an amine group, both of which withdraw electron density. But not all Ha protons resonate at 4.4 ppm: They are dispersed as low as ~3 and as high as ~5.5. Why? “Ha region”

115 “Average” or “random coil” chemical shifts in proteins
One reason for this dispersion is that the side chains of the 20 amino acids are different, and these differences will have some effect on the Ha shift. The table at right shows “typical” values observed for different protons in the 20 amino acids. These were measured in unstructured peptides to mimic the environment experienced by the proton averaged over essentially all possible conformations. These are sometimes called “random coil” shift values. Note that the Ha shifts range from ~4-4.8, but Ha shifts in proteins range from ~3 to 5.5. So this cannot entirely explain the observed dispersion.

116

117 Amino acid structures and chemical shifts
note: the shifts are somewhat different from the previous page because they are measured on the free amino acids, not on amino acids within peptides

118 Tabella 1H chemical shift in peptidi e proteine

119 chemical shifts in proteins. Secondary structure
Note that the Ha shifts range from ~4-4.8, but Ha shifts in proteins range from ~3 to 5.5. So this cannot entirely explain the observed dispersion.

120 A simple reason for the increased shift dispersion is that the environment experienced by 1H nuclei in a folded protein (B) is not the same as in a unfolded, extended protein or “random coil” (A). shift of particular proton in unfolded protein is averaged over many fluctuating structures will be near random coil value shift of particular proton in folded protein influenced by groups nearby in space, conformation of the backbone, etc. Not averaged among many structures because there is only one folded structure. So, some protons in folded proteins will experience very particular environments and will stray far from the average.

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122 Example: shielding by aromatic side chains in folded proteins
Picture shows the side chain packing in the hydrophobic core of a protein--the side chains are packed in a very specific manner, somewhat like a jigsaw puzzle + + a consequence of this packing is that some protons may be positioned within the shielding cone of an aromatic ring such as Phe 51. Such protons will exhibit unusually low resonance frequencies (see picture at left). Note that such effects depend upon precise positioning of side chains within folded proteins shielded methyl group methyl region of protein spectrum

123 so you can tell if your protein is folded or not by looking at the 1D spectrum...
poorly dispersed methyls poorly dispersed amides poorly dispersed alphas poorly dispersed aromatics unfolded ubiquitin very shielded methyl folded ubiquitin

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126 What specifically to look for in a nicely folded protein
notice aromatic/amide protons with shifts above 9 and below 7 notice alpha protons with shifts above 5 notice all these methyl peaks with chemical shifts around zero or even negative

127 Linewidths in 1D spectra: aggregation and conformational flexibility
Linewidths get broader with larger particle size, due to faster transverse relaxation rates. We’ll learn the physical basis for the faster relaxation later. Broader than expected linewidths can indicate that the protein is aggregated. It can also indicate that the protein has conformational flexibility, i.e. that its structure is fluctuating between several slightly different forms. We’ll learn why this is when we cover the effect of protein dynamics on NMR spectra. Conformational flexibility also tends to reduce dispersion by averaging the environment experienced by a nucleus.

128 An example of analyzing linewidths and dispersion:
Hill & DeGrado used measurements of chemical shift dispersion and line broadening in the methyl region of 1D spectra to gauge the effect of mutations at position 7 on the conformational flexibility of a2D protein leucine and valine mutants have poor dispersion and broad lines, despite being very stably folded and not aggregated (circular dichroism and analytical ultra- centrifugation measurements). These mutants are folded but flexible. Hill & DeGrado (2000) Structure 8:

129 Heteronuclei

130 13C NMR The rules discussed for 1H spins, (shielding and deshielding effects) hold also for 13C spins. Some general features of 13C should be pointed out: Unlike 1H atoms, 13C atoms may form a different number and type of chemical bonds. Therefore, the shielding/deshielding effects are much more effective. The chemical shift range of 13C spins spans more than 200 ppm

131 Range of observed shifts for 13C

132 A protein 13C NMR spectrum (low resolution)
Aromatic signals Aliphatic Backbone CO and side chain COO- signals

133 13C NMR The rules discussed for 1H spins, (shielding and deshielding effects) hold also for 13C spins. Some general features of 13C should be pointed out: The amino acid dependence of chemical shift values is stronger for 13C atoms than in 1H atoms. Therefore, each amino acid has an almost unique pattern of 13C chemical shifts

134 13C chemical shifts are residue-specific

135

136 13C NMR The rules discussed for 1H spins, (shielding and deshielding effects) hold also for 13C spins. Some general features of 13C should be pointed out: The chemical shift from secondary structure can be used to get the secondary structure arrangement directly from 13C shifts of Ca, Cb and C’ spins

137 Fig. 1. Simulated 13C   chemical-shift distribution of
(a) Ala and (b) Met. (•) Strand; (   ) coil; (  ) helix.

138 13C

139

140 15N: backbone and side chains

141

142 CH3 O S N NH OH OH HS H2C O H2C CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 Asp Glu Cys Met His HO O NH2 NH2 HO HO O H2C CH3 CH2 CH2 HC CH2 CH2 Ser Thr Asn Gln Tyr

143 Arg and Lys 15N side chain resonances are difficult to be detected (around 60 and 30 ppm)
Trp Ne at about 12 ppm in proton and 135 in 15N

144 protonated (chloride salt)
deprotonated watera DMSOb chloroformb terminal -NH2 (av value) 51.4 55.3c 49.3 68.1 59.2 54.2 internal -NH- 63.8 66.0 65.3 68 64.9 65.9 Arg side chain

145 Tautomeric equilibrium
His side chains N NH HN N d1 e2 CH2 CH2 Tautomeric equilibrium

146 170 and 260 ppm arise from the protonated and nonprotonated nitrogens, respectively