Applicazioni FARMACOLOGICHE: viene fornita un’indicazione specifica, o quanto meno restrittiva, della struttura opportuna in funzione del bersaglio del.

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1 Applicazioni FARMACOLOGICHE: viene fornita un’indicazione specifica, o quanto meno restrittiva, della struttura opportuna in funzione del bersaglio del farmaco. In questo campo, la costruzione di strutture calibrate permette di ridurre la ricerca ad un ristretto raggio d’azione.

2 Riconoscimento molecolare
E’ il punto di partenza per quasi tutti i processi biologici. Un modello di riconoscimento tra molecole biologiche prevede che le molecole interagiscono in una maniera altamente specifica: modello CHIAVE-SERRATURA (Fisher e Ehrilch) fisica24ore

3 La complementarità geometrica e chimica fra piccole molecole biologiche (LIGANDI) e le strutture dei loro bersagli macromolecolari (RECETTORI) gioca un ruolo molto importante all’interno dei processi biologici. fisica24ore

4 La capacità di un recettore di agganciarsi al suo ligando selettivamente e con alta affinità è dovuta alla formazione di una serie di legami deboli (legami H, ionici, interazioni di Van der Waals) sommati ad interazioni favorevoli (es. idrofobiche). Gli atomi del sito di legame forniscono l’impalcatura necessaria per conferire alla superficie un dato contorno e particolari proprietà chimiche Variazioni anche piccole di tali amminoacidi spesso compromettono la funzionalità del recettore

5 docking Docking Metodi computazionali per la predizione della struttura 3D di complessi proteina-ligando (o anche applicabile a modelli proteina/proteina). Insieme di tecniche che consentono di simulare interazioni tra vari sistemi (sito attivo di un enzima e una nuova molecola di inibitore) e di valutare approssimativamente le nuove interazioni che si creano.

6 In quest’ultimo caso, viene trovato il corretto modo di legame di un composto tramite il campionamento dello spazio conformazionale nel sito di legame, attraverso la valutazione di funzioni che stimano l’energia di ogni combinazione conformazionale ligando-recettore. Tali funzioni valutano fattori quali: Complementarità fra superficie Energia libera di solvatazione Interazioni elettrostatiche e idrofobiche

7 AUTODOCK, DOCK, FlexX, GOLD, …
algoritmi AUTODOCK, DOCK, FlexX, GOLD, … Algoritmi di docking. Posizionano ligandi – flessibili o semi-flessibili - in siti di binding proteici generalmente rigidi. Il ligando durante il binding cambia la sua struttura tridimensionale in termini di angoli di torsione per trovare il miglior adattamento spaziale ed energetico nel sito di binding della proteina. Questa assunzione segue il modello “chiave-serratura. Prendendo in considerazione anche la flessibilità del recettore allora andrebbero considerati centinaia o anche migliaia di gradi di libertà.

8 Sviluppo di farmaci Elemento chiave:
scoperta di composti guida nuovi e innovativi Composto guida = composto che mostra “affinità” per un dato recettore, che ha attività biologica e che può essere strutturalmente modificato per migliorare la bioattività

9 Tempi per lo sviluppo di un nuovo farmaco
Ricerca del composto guida (1-2 anni) Ottimizzazione del composto guida (1-2 anni) Saggi di attività in vitro e in vivo (1-2 anni) Test tossicologici (1-3 anni) Test per la sicurezza sull’uomo (1 anno) Test per l’efficacia sull’uomo (1-2 anni) Tempo totale per lo sviluppo di un nuovo farmaco: 6-12 anni Costo totale: circa $ è di grande importanza l’identificazione RAPIDA E AFFIDABILE di ligandi ad alta affinità

10 Ricerca di nuovi composti guida
Screening sperimentale: test in vitro di grandi librerie di composti. Ignora, in genere, le proprietà strutturali del recettore Metodi computazionali detti Rational Design: si basano su informazioni strutturali del recettore e/o del ligando fisica24ore

11 Metodi computazionali
Struttura 3D del recettore NON nota Struttura 3D del recettore nota Structure Based Drug Design QSAR (Quantitaive Structure-Activity Relationship) Stabilisce una relazione tra la struttura molecolare e l’attività biologica di una serie di composti attivi. Predice la attività e la affinità di composti non noti dall’analisi delle loro similitudini e differenze strutturali, fornendo informazioni sui requisiti strutturali del recettore. De Novo Design I nuovi composti vengono generati nel sito di legame a partire da atomi o frammenti preposizionati nel sito e che successivamente vengono trasformati in molecole intere da softwares specifici. Screening Virtuale Librerie di molecole (esistenti o ipotetiche) vengono analizzate cercando ligandi con caratteristiche in accordo con i requisiti del sito di legame Docking fisica24ore

12 Drug discovery Il termine di drug discovery viene utilizzato per indicare tutti quei processi che portano all’identificazione o allo sviluppo di un nuovo farmaco. Identificazione di un bersaglio (target) a cui è correlata una certa patologia su cui intervenire con un farmaco. Identificazione di una molecola attiva Studio delle molecole attive al fine di realizzare derivati con un più definito profilo di attività, metabolismo e tossicità (lead compounds) . Studi pre-clinici (animali). Studi clinici (uomo).

13 Drug discovery Il tempo è il “peggior nemico” nella drug discovery…
Portare un nuovo farmaco sul mercato puo’ richiedere 8-14 anni e costi tra 400 e 900 milioni di dollari

14 Riconoscimento molecolare
E’ il punto di partenza per quasi tutti i processi biologici. Le molecole interagiscono in una maniera altamente specifica: modello CHIAVE-SERRATURA La complementarità geometrica e chimico-fisica fra piccole molecole biologiche (LIGANDI) e le strutture dei loro bersagli macromolecolari (RECETTORI) gioca un ruolo molto importante all’interno dei processi biologici.

15 Riconoscimento molecolare
La capacità di un recettore di agganciarsi al suo ligando selettivamente e con alta affinità è dovuta alla formazione di una serie di legami deboli (legami H, ionici, interazioni di Van der Waals, interazioni idrofobiche…). Gli atomi del sito di legame forniscono l’impalcatura necessaria per conferire alla superficie un dato “contorno” e particolari proprietà chimiche Variazioni anche piccole di tali amminoacidi spesso compromettono la funzionalità del recettore Perché un farmaco possa esplicare la propria azione deve interagire con un bersaglio chiamato recettore.

16 Progettazione razionale di molecole bioattive
Avvalendosi di tecniche computazionali, nota la struttura tridimensionale del recettore o un suo modello (tecniche di docking molecolare) L’obiettivo è quello di ottenere un modello chiamato farmacoforo sulla base del quale verranno progettate le nuove molecole attive. E’ l’insieme delle caratteristiche chimico-fisiche della molecola di un farmaco necessarie all’interazione col recettore.

17 Il docking molecolare Si tratta di un approccio computazionale per lo studio delle interazioni fra un generico ligando (es. potenziale molecola attiva) e una macromolecola bersaglio (target). E’ necessario conoscere la struttura 3D sia del ligando, sia della macromolecola bersaglio. Le informazioni estrapolabili da uno studio di docking possono servire per: l’identificazione degli elementi strutturali chiave per l’interazione sia del ligando, sia del recettore (modello farmacoforo); la progettazione di nuove molecole attive con maggiore affinità e, conseguentemente con maggiore potenza; ipotizzare un plausibile meccanismo d’azione.

18 Struttura 3D del ligando
C19H23NO5 Formula chimica 3D

19 Struttura 3D del recettore
Può trattarsi di un problema estremamente complesso soprattutto se non si dispongono di informazioni sperimentali sufficienti, viste le elevate dimensioni che un recettore presenta (> atomi). Cristallografia a raggi X Risonanza magnetica nucleare (NMR) Predizione della struttura 3D Accuratezza della struttura 3D Metodica sperimentale Metodica computazionale

20 Docking molecolare L’operatore è guidato dalla grafica computerizzata e programmi appositi che posizionano il ligando nella tasca del recettore. Docking La validità del complesso (o orientamento) risultante è stimata mediante un punteggio energetico. Valutare la validità delle soluzioni proposte dal punto di vista chimico-farmaceutico-biologico. Ligando Recettore

21 Molecole potenzialmente
Lo screening virtuale di librerie di potenziali ligandi Strumento basato su metodiche computazionali atto all’identificazione di composti biologicamente attivi a partire da banche dati di strutture reali o puramente virtuali. Virtuale Test farmacologico Sintesi chimica (decine) Molecole attive (alcune unità) Reale Database di composti (milioni) Modello farmacoforo Molecole potenzialmente attive (decine)

22 Molecole potenzialmente
Lo screening virtuale Modello farmacoforo Database di composti reali (migliaia) Molecole potenzialmente attive (decine) Virtuale Test farmacologico Molecole attive (alcune unità) Reale Situazione tipica di un’industria farmaceutica. Vantaggi: risparmio di tempo nello sviluppo = risparmio di denaro.

23 La neuroaminidasi del virus dell’influenza
Lo screening random d’inibitori della sialidasi virale non ha dato buoni risultati nella ricerca di nuovi farmaci anti-influenzali mentre il drug design basato sulla struttura ha portato alla progettazione di nuove molecole (analoghi dello stato di transizione della reazione catalizzata dalla sialidasi) attualmente in uso. Infatti il virus dell’influenza e’ in continua evoluzione, ogni anno nuovi ceppi. La denominazione del virus si riferisce a due tipi di molecole che ricoprono la superficie del virus: emoagglutinina e la neuroaminidasi (sialidasi). Esse determinano l’infettivita’ del virus. Diversi sottotipi neuroaminidasi N1-N9. Questi inibitori in uso interferiscono con il rilascio della progenie del virus dell’influenza dalle cellule infettate, bloccando in questo modo l’infezione. La sialidasi entra in gioco quando il virus abbandona la cellula infettata. Assicura che il virus non resti legato ai polisaccaridi della superficie (derivati dell’ acido sialico) tagliando le loro catene. Il virus dell'influenza è in continua evoluzione, ogni anno sentiamo parlare di nuovi ceppi, in realtà ogni dieci anni circa, un nuovo ceppo pericoloso appare e costituisce una minaccia per la salute pubblica. L'anno scorso, c'è stato un focolaio di un nuovo ceppo di virus influenzale, l'H1N1, più comunemente noto come virus dell'influenza suina. La denominazione H1N1 si riferisce a due tipi di molecole che ricoprono la superficie del virus: emoagglutinina e neuroaminidasi. Insieme, queste due molecole determino l'infettività del virus. L'emoagglutinina svolge un ruolo determinante quando il virus si avvicina alla cellula legandosi alle catene di polisaccaride sulla superficie cellulare e poi iniettando il DNA virale nella cellula. La neuraminidasi, d'altra parte, entra in gioco quando il virus abbandona la cellula infettata. Assicura che il virus non resti legato ai polisaccaridi della superficie tagliando le loro catene. Tagliare gli zuccheri La neuraminidasi, mostrata qui in alto dal file PDB 1nn2, è formata da quattro subunità identiche disposte a quadrato. Normalmente è legata alla superficie del virus con un lungo braccio proteico, non mostrato. I siti attivi si trovano in profondi avvallamenti della superficie in alto, si legano alle catene di polisaccaridi cellulari e ne tagliano gli zuccheri terminali. La superficie della neuraminidasi ha legate alcune catene di polisaccaridi che, nella struttura in alto, si vedono estendersi verso l'alto e verso il basso e sono simili alle catene di polisaccaridi presenti sulle proteine di superficie delle nostre cellule. Maiali e persone Come l'emoagglutinina, anche nel caso della neuraminidasi esistono vari sittotipi noti come N1-N9. Questi sottotipi vengono definiti in base alla loro interazione con gli anticorpi: tutte le varianti di uno stesso sottotipo vengono neutralizzati dallo stesso tipo di anticorpi. Questi sottotipi sono una delle cause della continua aggressività dell'influenza. Alcuni sottotipi possono infettare le persone, altri infettano gli uccelli ed altri ancora possono attaccano i maiali o altri tipi di mammiferi. Quando virus diversi infettano uno stesso organismo, i vari sottotipi si possono mescolare e combinare tra loro in modo diverso dando luogo a nuove combinazioni casuali che occasionalmente si possono rivelare particolarmente pericolose o addirittura mortali; portando quindi alla formazione di nuovi ceppi.

24 Meccanismo d’azione di inibitori della Neuroaminidasi

25 Struttura 3D Neuroaminidasi
La sialidasi virale è un enzima costituito da 4 subunità identiche ancorato alla membrana del virus. L’abilità degli analoghi dello stato di transizione del substrato della sialidasi virale nell’inibirla è conosciuta dagli anni ‘70. La progettazione d’inibitori più efficenti, però, è stata possibile solo quando la prima struttura 3D dell’enzima è stata risolta mostrando l’orientazione degli amminoacidi nel sito catalitico.

26 Struttura 3D Neuroaminidasi
Questo farmaco anti-influenzale è in commercio sotto il nome di Tamiflu (oseltamivir). E’ un anello a 6 atomi di carbonio che mima i substrati naturali della sialidasi e ottimizza le interazioni con i residui degli amminoacidi del sito attivo. I ricercatori sono riusciti a progettarlo studiando le strutture della neuroaminidasi. Si lega fortemente al sito attivo e ne blocca l’azione indispensabile per il rilascio del virus. Combattere l'influenza Due sono i farmaci più efficaci attualmente in uso per combattere l'influenza: zanamivir (Relenza) e oseltamivir (Tamiflu). Questi farmaci sono stati scoperti usando strutture cristalline prese dagli archivi PDB. Studiando il legame di varie molecole con il sito attivo della neuraminidasi, i ricercatori sono riusciti a progettare nuovi farmaci che imitano i substrati naturali dell'enzima. Queste molecole si legano fortemente nel sito attivo e ne bloccano l'azione che è indispensabile per il rilascio del virus dalla membrana cellulare. Qui sono mostrate due strutture di questi farmaci. Al centro, file PDB 3b7e, è mostrato zanamivir (blu) legato alla neuraminidasi del virus dell'influenza spagnola che ha causato una pandemia nel In basso, file PDB 2hu4, è mostrato oseltamivir (blu) legato alla neuraminidasi del virus dell'influenza aviaria. Anticorpi e vaccini Quando ci ammaliamo d'influenza, il nostro sistema immunitario produce anticorpi per combattere il virus. Un vaccino antiinfluenzale può preparare il sistema immunitario per questa azione protettiva mettendolo a contatto con virus indeboliti o con frammenti innocui del virus. In questo modo il vaccino permette al sistema immunitario di produrre i giusti anticorpi prima che si verifichi l'infezione vera e propria. Gli anticorpi riconoscono le proteine sulla superficie del virus. Gli anticorpi più efficaci sono quelli che attaccano l'emoagglutinina e così bloccano l'infezione di nuove cellule. Gli anticorpi contro la neuraminidasi, come quelli mostrati qui in blu, l'immagine proviene dal file PDB 1nca, possono rendere l'influenza più leggera e così anche loro aiutano a combattere il virus. Esplorando la Struttura Per progettare un farmaco in grado di curare le persone bisogna prestare grande attenzione. I farmaci devono essere diversi dal substrato naturale dell'enzima così che l'enzima non possa catalizzare la reazione per distruggerli. Nello stesso tempo i farmaci devono essere molto simili al naturale substrato dell'enzima in modo da legarsi fortemente al sito attivo per bloccarlo. E' anche molto importante che i farmaci siano simili ai substrati naturali per evitare la resistenza ai farmaci. Un esempio di questo problema è illustrato nelle tre figure qui sotto La prima figura mostra la neuraminidasi legata all'acido sialico nel suo sito attivo, file PDB 2bat. Questa figura mostra la normale interazione dell'enzima con un polisaccaride, il suo substrato naturale. La seconda figura mostra il legame con oseltamivir, uno dei farmaci usati per combattere l'influenza, file PDB 2hu4. Notate che questo è simile, ma non identico all'acido sialico. E' leggermente più grande e costringe un acido glutammico (rosa) a piegarsi un po' verso l'istidina sopra di lui (anche questa rosa). La terza figura mostra una variante dell'enzima che ha sviluppato farmacoresistenza, file PDB 3cl0. In questo enzima mutante, l'istidina è stata sostituita da una tirosina (Tyr274 rosa) che, essendo più grande, spinge l'acido glutammico in basso verso il farmaco. Oseltamivir può ancora legarsi, ma in modo meno forte a causa dell'interferenza con l'acido glutammico (rosa) e quindi può essere scalzato via dal polisaccaride, il substrato naturale. Il farmaco risulta quindi inefficace per combattere il virus mutante. In ogni caso vi è ancora spazio sufficiente per legare l'acido sialico e quindi l'enzima mutante funziona ancora per svolgere la sua normale azione di rilascio del virus.

27 fisica24ore

28 In conclusione... Le tecniche computazionali rappresentano uno strumento molto utile per: la modellazione di sistemi proteici la comprensione dei processi biologici la comprensione della relazione struttura-attività la scoperta e ottimizzazione dei composti guida farmacologici Vantaggio dal punto di vista biologico, chimico e farmaceutico, riducendo i tempi e completando e indirizzando le conoscenze sperimentali