CdL Medicina Corso ufficiale di Biologia Molecolare del corso di Biochimica Lezioni: Martedì ore 11-13 Paolo Arosio Esame: test scritto, discussione orale.

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1 CdL Medicina Corso ufficiale di Biologia Molecolare del corso di Biochimica Lezioni: Martedì ore 11-13 Paolo Arosio Esame: test scritto, discussione orale

2 Libri Molecular cell Biology, Lodish e coll. Molecular Biology of the Cells, Alberts e coll Genes, Lewin BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, WATSON James D e coll. zanichelli ed-

3 Biologia Molecolare La biologia molecolare studia le funzioni biologiche a livello molecolare delle macromolecole informazionali Scopo del corso: studiare le conoscenze delle macromolecole e dei meccanismi molecolari che sono alla base della conservazione, riparazione, duplicazione e trascrizione degli acidi nucleici, della maturazione dei trascritti, degli eventi post trascrizionali nella sintesi delle proteine, e del loro targeting in sistemi procarioti ed eucarioti. Tali conoscenze potranno essere usate in applicazioni biotecnologiche.

4 Le molecole Carboidrati lipidi Proteine Acidi nucleici

5 Proteine: Legame peptidico

6 Alfa elica

7 beta

8 Ordini di struttura

9 Amino acid chemical modifications Lys: acetylation, methylation Arg: methylation Ser and Thr: phosphorylation, acylation, O-linked gkycosylation Tyr; sulfation, phosphorylation, Cys: acylation Asn: N-glycosylation

10 Categories of Covalent Modifications Modifications: Arg:Mono- & Di-methylation His:Phosphorylation (H4) Lys: Acetylation Mono-, Di-, & Tri-methylation Ubiquitination Sumoylation Ser/Thr: Phosphorylation

11 DNA

12 Le basi Tautomeria delle basi: Ammino –immino Cheto -enolica

13 Le coppie di basi A:T e G:C hanno lo stesso ingombro trasversale Gli accoppiamenti causano un accoppiamento antiparallelo Stabilizzato da fattori entropici Da impilamento delle basi Da legami H (specificità) Incompatibilità A:C

14 Base flipping Energeticamente facile Permette laccesso alle basi per Metilazione Rimozione di basi Verifica complementarietà

15 Solco maggiore e minore Il solco maggiore offre informazioni: A: accettore legame H D: donatore legame H M: metile H:idrogeno A:T ADAM, T:A MADA G:C AADH, C:G HDAA Solco minore: A:T AHA, G:C ADA

16 Strutture DNA La struttura B è la più comune La A è più compatta e fatta dallRNA La Z è levogira e fatta a Zig-Zag

17 Conformazioni DNA In soluzione il DNA ha 10.5 bp per giro di elica, assume conformazioni lievemente diverse in base alla sequenza, con torsioni delle basi Nella forma Z il DNA è levogiro. Le purine assumono conformazione anti, invece che sin È favorita da alti sali

18 Denaturazione del DNA Bassi sali Alti sali

19 Topologia del DNA Linking number Lk: numero di volte che un filamento deve essere passato attraverso laltro per separare le due catene Twist number Tw: numero di volte che un filamento gira intorno allaltro Writhe number Wr: numero di incroci dellasse longitudinale Lk = Tw + Wr

20

21 Un DNA rilassato è indicato da Lk 0. Lk effettivo è uguale al n di bp / 10.5. Per rilassare il DNA superavvolto si può fare un nick Differenza di linking: Lk = Lk-Lk 0 Se esso è negativo lavvolgimento è negativo. Come è di solito, la separazione dei due filamenti è favorita. Come nei nucleosomi

22 Topoisomerasi II ATP dipendente

23 Toposomerasi I La girasi introduce sopravvolgimenti negativi per facilitare replicazione o trascrizione

24 Decatenazione, districazione, snodamento del DNA

25 Topoisomerasi I Le topoisomerasi usano una tyr che opera un attacco nucleofilo al DNA. Lintermedio ha un legame covalente. Non si ha consumo di energia

26 Meccanismo dellaTopoisomerasi I

27 Separazione di DNA La migrazione dei topoisomeri dipende dal numero di superavvolgimenti della molecola

28 Etidio bromuro Il DNA è un colorante per la colorazione del DNA. La sua fluorescenza aumenta quando si intercala al DNA. Causa uno srotolamento e diminuisce il Twist. Il DNA circolare superavvolto viene srotolato, e quello rilassato viene superavvolto positivamente

29 RNA Differenze da DNA: Ribosio Uracile Singola elica Funzioni: Intermediario: mRNA Raccordo: tRNA Regolazione: MicroRNA, siRNA Enzima: ribosomi etc.

30 Doppia elica RNA Strutture hairpin, loop, bulge Alcuni loop sono stabili, esempio cUUCGg

31 strutture RNA Pseudonodi Appaiamenti non Watson-Crick

32 strutture RNA RNA a doppia elica può fare solo struttura A, per lingombro del 2OH Solco maggiore meno accessibile, quello minore più accessibile Può formare complesse strutture secondarie

33 Ribozimi La possibilità di fare strutture secondarie e la reattività del 2OH permettono allRNA di avere attività enzimatica, generalmente di tagliare RNA RNAsi P, processa tRNA Ribonucleoproteine: RNA splicing Ribonucleasi Hammerhead: tratti di RNA che tagliano sequenze contigue

34 In biologia I meccanismi fondamentali sono estremamente conservati I particolari individuali sono estremamente vari

35 Caratteristiche universali Lereditarietà e depositata sempre nella stessa molecola, DNA Parte dellinformazione ereditaria è trascritta sempre nella stessa forma, RNA Le proteine sono catalizzatori e sono tradotte sempre nello stesso modo Un gene, una proteina Le piccole molecole sono simili (zuccheri, amino acidi, nucleotidi, ATP, etc) Le cellule sono racchiuse in membrane Bastano meno di 500 geni per la vita (es. Mycoplasma genitalium, 477 geni)

36 procarioti E. coli (4.639.221 bp, 4300 geni) è il modello dei batteri

37 Modelli Lievito, S. cerevisiae Arabidopsis thaliana Caenorhabditis elegans Drosofila melanogaster Mouse

38 genomi Perché i genomi sono grandi Come sono organizzati

39 Quantità minima di DNA Il grafico indica che un aumento della grandezza del genoma è necessaria per la complessità dei procarioti ed eucarioti inferiori

40 I geni sono interrotti Negli eucarioti la maggior parte dei geni sono interrotti da introni. Spesso lorganizzazione introni-esoni è conservata

41 La dimensione dei geni varia grandemente

42 Dimensione esoni e introni La lunghezza media degli esoni non varia, quella degli introni aumenta con la filogenesi

43 Geni batterici Nei batteri quasi tutto il DNA codifica proteine o RNA Il genoma varia entro un ordine di grandezza ed è proporzionale al numero di geni

44 Geni negli eucarioti Il genoma degli eucarioti unicellulari è simile a quello dei procarioti Gli eucarioti superiori hanno più geni, ma il loro numero non correla con la dimensione del genoma

45 Famiglie di geni Alcuni geni sono unici, altri appartengono a famiglie Il n° di geni aumenta con la complessità, ma negli eucarioti superiori il n° di famiglie rimane costante

46 Famiglie di geni Ortologhi: geni di due specie che derivano da un ancestrale comune e probabilmente hanno la stessa funzione Paraloghi: provengono da una duplicazione nello stesso genoma, probabilmente con funzioni diverse Omologo: termine più generico per entrambi

47 Famiglie e genomi La proporzione di geni unici diminuisce con la grandezza del genoma, aumenta la dimensione delle famiglie

48 Come identificare i geni Lorganizzazione di un gene è costante Ma esistono molti pseudogeni Lordine dei geni nel cromosoma è spesso conservata: sintenia (uomo e topo)

49 Geni nei mammiferi Solo 1% del genoma umano consiste di regioni codificanti Gli esoni occupano 5% di ogni gene, quindi i geni occupano 25% del genoma Il genoma umano ha 30-40.000 geni 60% dei geni umani hanno splicing alternativi Il proteoma ha 50-60,000 membri

50 Geni nel genoma di topo Circa 30.000 geni per proteine 4000 pseudogeni 800 geni per RNA

51 Il gene umano medio In media un gene umano ha 9 esoni e 7 introni ed è lungo 27 kb. Gli esoni terminali sono più lunghi. Solo 5% è codificante

52 Distribuzione dei geni nel genoma Circa il 20% del genoma umano consiste di deserti senza geni Sequenze ripetitive –Trasposoni –Pseudogeni Processati –Simple sequence repeats –Duplicazioni di segmenti –Tandem repeats

53 Funzioni essenziali

54 Quanti geni sono essenziali? Esperimenti di inattivazione di geni sono stati fatti in batteri, lieviti, C. elegans. Solo 10- 20% erano essenziali

55 Abbondanza del RNA Abbondanza di mRNA: n° medio di molecole per cellula mRNA abbondanti: 1000-10.000 copie per cellula mRNA scarsi: >10 copie per cellula Spesso gli mRNA abbondanti sono in piccolo numero, sono specifici delle cellula (luxury) La maggior parte degli mRNA sono scarsi, ed espressi in tutte/molte cellule: housekeeping o costitutive

56 Organizzazione dei geni -I Nei procarioti ed eucarioti inferiori le regioni codificanti sono densamente allineate nel DNA genomico Nei vertebrati molte sequenze non codificano e non hanno funzioni regolatorie, e la maggior parte di questo DNA è composta da sequenze ripetute. Nelluomo solo 1.5% del DNA codifica RNA funzionale Le variazione della quantità di DNA non funzionale sono responsabili della mancanza di relazione tra complessità filogenetica e quantità di DNA aploide Il DNA genomico degli eucarioti contiene tre classi principali di sequenze: geni codificanti, DNA ripetitivo e DNA spacer Circa la metà dei geni codificanti per proteine nel DNA genomico dei vertebrati sono geni solitari, gli altri sono geni duplicati

57 Organizzazione dei geni -II I geni duplicati codificano proteine simili, e sono spesso in cluster. Le proteine codificate da famiglie geniche hanno sequenze e proprietà simili ma distinte Nei vertebrati ed invertebrati gli rRNA sono codificati da molte copie di geni in tandem arrays. Le copie multiple dei geni per gli istoni e tRNA spesso sono in clusters, ma non in tandem arrays. Sequenze semplici di DNA (sequenze corte e ripetute in tandem arrays lunghi) sono preferenzialmente localizzati nei centromeri, telomeri ed in specifiche regioni del cromosoma La lunghezza di alcune Sequenze semplici di DNA varia negli individui e sono la base di DNA fingerprint