Ruolo di TDP43 nella Sclerosi Laterale Amiotrofica

Presentazione sul tema: "Ruolo di TDP43 nella Sclerosi Laterale Amiotrofica"— Transcript della presentazione:

1 Ruolo di TDP43 nella Sclerosi Laterale Amiotrofica
Internato di tesi svolto presso il Dipartimento di Scienze Neurologiche, Università degli Studi di Milano Fondazione IRCCS CA’ GRANDA Ospedale Maggiore Policlinico Relatore: Chiar.ma Prof.ssa Silvia DE BIASI Correlatore: Chiar.mo Prof. Giacomo P. COMI Tesi di Laurea di: Serena Diana Ghezzi

2 Sclerosi Laterale Amiotrofica
La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una patologia neurodegenerativa fatale, risultato del preminente interessamento dei motoneuroni superiori e inferiori. La durata di malattia dal momento dell’esordio dei sintomi è in media di 3-5 anni con un decorso più rapido nelle forme ad esordio bulbare. tipo di SLA gene classe geni mendeliani SLA1 SOD1 enzima detossificante SLA2 ALS2 signali GEF SLA4 SETX metabolismo del DNA e dell’ RNA SLA5 SPG11 recettore o trasportatore di membrana SLA6 FUS legame al RNA, silenziamento e riparo del DNA SLA8 VAPB traffico vesciculare SLA9 ANG neovascolarizzazione SLA10 TARDBP legame all’RNA ed exon skipping SLA DCTN1 trasporto assonale SLA-FTDP MAPT assemblamento dei microtubuli e loro stabilità loci mendeliani SLA3 Ignoto Ignota SLA7 SLA-X SLA-FTD1 SLA-FTD2 L’exitus avviene generalmente in seguito a paralisi della muscolatura respiratoria La diagnosi è essenzialmente clinica, non esiste infatti un test diagnostico specifico. 5-10% familiari (SLAf) 90-95% sporadici (SLAs) Dati familiari ed epidemiologici indicano che i fattori genetici contribuiscono alla sua patogenesi. INTRODUZIONE

3 TARDBP La proteina TAR DNA binding protein (TDP43) è il principale componente delle inclusioni citoplasmatiche neuronali ubiquitino-positive presenti nella maggior parte dei casi SLAs e di SLAf negativi per mutazioni di SOD1 Nel tessuto nervoso dei pazienti SLA, TDP43 è iperfosforilata, ubiquitinata e clivata in modo anomalo. Si ipotizza che in condizioni patologiche la proteina sia eliminata dal nucleo e si accumuli a livello del citoplasma innescando la degenerazione motoneuronale INTRODUZIONE

4 TARDBP (TDP43) regolazione della trascrizione
ex1 ex2 ex3 ex4 ex5 ex6 1p36 RRM1 RRM2 GRR NLS 414 aa, 43 KDa sito di interazione hnRNP siti di interazione con l’mRNA segnale di localizzazione nucleare Sito di clivaggio (aa86-89) Sito di clivaggio (aa ) regolazione della trascrizione regolazione dello splicing stabilità dell’mRNA INTRODUZIONE

5 OBIETTIVI Lo scopo del nostro studio è stato quello di caratterizzare geneticamente l’ampia coorte di pazienti SLA afferenti all’Ambulatorio Malattie del Motoneurone – Dipartimento di Scienze Neurologiche – Policlinico di Milano. Tale studio ci ha permesso di individuare la mutazione A382T risultata essere la variante più comune sul territorio nazionale. Abbiamo quindi costruito un modello cellulare che permettesse di studiare in vitro gli effetti di tale mutazione. SCOPO

6 4 mutazioni missenso in 5 casi (2 familiari e 3 sporadici)
SCREENING GENETICO Pazienti SLA Soggetti SANI numero di soggetti 213 181 casi familiari 26 genere (M/F) 122/91 102/79 età di insorgenza (anni) 58.3 ± 12.8 età al prelievo (anni) 60.8 ± 12.5 67.4 ± 8.8 insorgenza bulbare 21.4% durata della malattia (mesi) 31.6 ± 29.4 SOD1, VAPB e ANG positivi nessuno L’età d’esordio dei pazienti mutati è pari in media a 59 anni (range: 50 – 72 anni). Fa eccezione la mutazione G348C che è risultata associata, in alcuni soggetti, ad un’età d’esordio precoce (fino a 34 anni). 4 mutazioni missenso in 5 casi (2 familiari e 3 sporadici) La frequenza mutazionale è risultata pertanto essere del 2.3% calcolata sull’intera coorte di pazienti (1.6% nelle forme sporadiche e 7.7% in quelle familiari). RISULTATI

7 SCREENING GENETICO SLAf SLAs p.Gly348Cys p.Ala382Thr RISULTATI
II:1 II:2 II:3 II:4 III:1 III:2 III:3 III:4 III:5 III:6 III:7 III:8 IV:1 IV:2 IV:3 IV:4 IV:5 IV:6 IV:7 IV:8 IV:9 IV:10 V:1 V:2 V:3 V:4 V:5 V:6 V:7 V:8 V:9 VI:1 VI:2 VI:3 VI:4 VI:5 VI:6 VI:7 VI:8 p.Gly348Cys I:1 I:2 II:1 II:2 II:3 II:4 II:5 II:6 II:7 II:8 III:1 III:2 III:3 III:4 III:5 III:6 III:7 III:8 III:9 IV:1 IV:2 IV:3 p.Ala382Thr SLAf SLAs G294V G295S G348C A382T c.881G>T p.Gly294Val c.883G>A p.Gly295Ser c.1144G>A p.Ala382Thr RISULTATI

8 SCREENING GENETICO RISULTATI c.881G>T p.Gly294Val
p.Gly348Cys p.Ala382Thr c.881G>T p.Gly294Val ex1 ex2 ex3 ex4 ex5 ex6 c.883G>A p.Gly295Ser c.1144G>A p.Ala382Thr RRM1 RRM2 GRR NLS RISULTATI

9 Costruzione del modello cellulare
820bp 820bp 965bp A B 521bp c.1144G>A p.Ala382Thr NdeI B A ficol mRNA cDNA RISULTATI

10 Validazione del modello cellulare
actina hHEK hSK-N-SH mES 45 KDa NT WT A382T Western-Blot hHEK hSK-N-SH TDP43 DAPI MERGE NT WT A382T Immunocitochimica mES RISULTATI

11 Validazione del modello cellulare
GAPDH TDP43 RISULTATI

12 Costruzione del modello con GFP
hHEK TDP43WTGFP DAPI TDP43 MERGE wt A382T TDP43A382TGFP RISULTATI

13 CONCLUSIONI GENETICA Il quadro clinico della SLA10 è analogo a quello della malattia classica, con qualche variabilità interfamiliare per quanto riguarda età e sito di esordio Paziente genere paese d’origine ereditarietà TDP43 insorgenza durata (mesi) età sede A, V:3 M Belgio AD G348C 50 spinale 36 a A, V:1 53 - A, III:3 F b 67 36-48 A, III:4 39 36 A, III:5 - a A, III:6 54 A, IV:1 66 48 A, IV:3 58 A, IV:6 60 B, III:2 Italia A382T spinale con crampi agli arti inferiori 60 a B, II:5 spinale con debolezza all’arto superiore sinistro C sporadica spinale con paresi alla mano sinistra D G294V 73 spinale con debolezza progressiva agli arti inferiori E G295S 64 spinale con debolezza e atrofia agli arti superiori 36a La frequenza mutazionale del gene TARDPB nella nostra coorte di paziente è risultata pari al: 1.6% nei casi sporadici (sovrapponibile a quanto riportato in letteratura) 7.7% nei casi familiari (maggiore di quanto descritto, circa il 5%). E’ interessante notare come, per quanto riguarda le forme di SLA a trasmissione autosomica dominante, la rilevanza mutazionale di TARDBP sia paragonabile, se non superiore, a quella di SOD1, nel nostro come in altri studi. DISCUSSIONE

14 CONCLUSIONI ANALISI FUNZIONALE
Per poter studiare gli effetti in vitro della mutazione A382T abbiamo costruito due modelli cellulari per overesprimere TDP43 sia nella forma wild-type che quella mutata. actina hHEK 45 KDa NT WT A382T hSK-N-SH 45 KDa NT WT A382T mES 45 KDa NT WT A382T DISCUSSIONE

15 CONCLUSIONI ANALISI FUNZIONALE
Per poter studiare gli effetti in vitro della mutazione A382T abbiamo costruito due modelli cellulari per overesprimere TDP43 sia nella forma wild-type che quella mutata. 2 3 1 45 KDa HEK non trasfettate HEK TDP43WT HEK TDP43A382T mRNA non tradotto proteina degradata DISCUSSIONE

16 PROSPETTIVE Proseguire la caratterizzazione genetica
Approfondire lo studio dei meccanismi di degradazione proteica Verificare l’eventuale regolazione dei livelli di trascritto Confermare i dati fin qui ottenuti anche con i modelli esprimenti la proteina legata alla GFP Replicare gli esperimenti validati nelle HEK anche in un modello neuronale (es. SK-N-SH) Valutare i meccanismi di neurogenesi nei modelli cellulari fin qui descritti DISCUSSIONE

17 RINGRAZIAMENTI