Misure con biomarcatori I. Generalità Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in Scienze per lAmbiente e il Territorio Copyright © 2001-2006.

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1 Misure con biomarcatori I. Generalità Prof. Giorgio Sartor Corso di Laurea Specialistica in Scienze per lAmbiente e il Territorio Copyright © 2001-2006 by Giorgio Sartor. All rights reserved. Versione 3.0 - gennaio 2006

2 gs © 2001-2006 ver 3.0Misure con biomarcatori I2 Indice Generalità Enzimologia Tecniche analitiche Biomarkers di genotossicità Markers enzimatici e loro significato Markers di funzionalità cellulare

3 gs © 2001-2006 ver 3.0Misure con biomarcatori I3 Biomonitoraggio La regolare e sistematica valutazione delle condizioni dellambiente mediante un insieme di metodiche che utilizzano specie animali o vegetali per misurare limpatto degli agenti inquinanti sullambiente.

4 gs © 2001-2006 ver 3.0Misure con biomarcatori I4 Biomarcatori di inquinamento Le risposte che un organismo genera nei confronti dei composti inquinanti rappresentano potenziali Biomarkers Variazione indotta da un contaminante a livello di componenti biochimiche o cellulari di un processo, di una struttura o di una funzione.

5 gs © 2001-2006 ver 3.0Misure con biomarcatori I5 Biomarkers Misura funzionale dellesposizione ad agenti stressori espressa a livello sub- organismico, fisiologico, comportamentale. (McCarthy and Munkittrick, 1996)

6 gs © 2001-2006 ver 3.0Misure con biomarcatori I6 Perché i biomarkers Rapporto costo-risultato Rapidi Robusti Informativi Rappresentano differenti livelli biologici Generali/specifici (Semplici)

7 gs © 2001-2006 ver 3.0Misure con biomarcatori I7 Biomarkers Biomarkers generali –Sono indice di una alterazione generale dellambiente. Biomarkers specifici –Sono la risposta ad uno specifico inquinante. Batteria di biomarkers –Insieme di biomarcatori in grado di dare risposte integrate.

8 gs © 2001-2006 ver 3.0Misure con biomarcatori I8 Biomonitoraggio mediante biomarkers VANTAGGI –Precocità della risposa –Rivela leffetto sinergico degli inquinanti –Rivela linquinamento anche quando la causa è scomparsa SVANTAGGI –Influenza delle condizioni chimico- fisiche ambientali sugli organismi –Variabilità biologica Età Genere Stato riproduttivo Stadio di sviluppo Dieta Isoenzimi

9 gs © 2001-2006 ver 3.0Misure con biomarcatori I9 Inquinante o xenobiotico ASSORBIMENTO Distribuzione (sangue, tessuti) Biotrasformazione Metaboliti attivi Metaboliti inattivi Distribuzione (sangue, tessuti) ESCREZIONE Legame a siti criticiLegame a siti non critici Prodotti di degradazione Effetti non tossici Danni reversibili Lesioni precliniche Lesioni cliniche MONITORAGGIO AMBIENTALE MONITORAGGIO dellesposizione biologica MONITORAGGIO delleffetto biologico Meccanismi di riparo DIAGNOSI

10 gs © 2001-2006 ver 3.0Misure con biomarcatori I10 Organismo sano Effetto sub-letale Danno allorganismo Danno alla popolazione Organismo Bio-accumulatore Alta tolleranza agli inquinanti Capacità di bio-accumulo Organismo Bio-indicatore Sensibilità agli inquinanti Tolleranza allo stress INQUINANTE BIOMARKERS CONTROLLO

11 gs © 2001-2006 ver 3.0Misure con biomarcatori I11 Metabolismo degli xenobiotici Metaboliti MECCANISMI DI SCAVENGING Il monitoraggio biologico e lutilizzo di biomarcatori METALLOTIONEINE O2O2 ROS DANNI CELLULARI Inquinamento MetalliXenobiotici ROS

12 gs © 2001-2006 ver 3.0Misure con biomarcatori I12 Effetto sinergico di inquinanti Danno perossidativo alle membrane lisomiali Danno perossidativo alle membrane lisosomiali IDROLASI lipofuscine DNA LISOSOMI Alterazioni del DNA RiparateNon riparate Mutazioni Tumori e carcinogenesi Aberrazioni ai cromosomi Apo-tioneine metallotioneine CytP450 Stimolazione sintesi mRNA Stimolazione sintesi mRNA ESCREZIONE Biotrasformazione Metaboliti METALLI PESANTI XENOBIOTICI ORGANICI METALLI PESANTI ORGANOMETALLI (Sn) INDUZIONE della SINTESI PROTEICA HSP

13 gs © 2001-2006 ver 3.0Misure con biomarcatori I13 Schema generale del metabolismo degli xenobiotici LipofiloIdrofilo XenobioticoMetabolita Fase I (ossidazione) Fase II (sintesi) Variazione di polarità Variazione di funzionalità Variazione di dimensioni Variazione di carica Variazione di solubilità Diminuzione dellattività biologica Aumentata escrezione

14 gs © 2001-2006 ver 3.0Misure con biomarcatori I14 Per esempio… P450 idrossilazione Benzene Fase I Aggiunta di un gruppo funzionale Fenolo Coniugazione con il solfato Fase II Coniugazione con lacido glucuronico Fenilsolfato Fenilglucoronide Maggiori dimensioni e aumentata idrofilia

15 gs © 2001-2006 ver 3.0Misure con biomarcatori I15 Biomonitoraggio mediante biomarkers Effetti sub-letali –Alterazioni del DNA –Alterazione del sistema immunitario –Alterazioni biochimiche –Alterazioni morfologiche

16 gs © 2001-2006 ver 3.0Misure con biomarcatori I16 Biomonitoraggio mediante biomarkers Alterazioni del DNA (genotossicità) –Addotti al DNA –Danni al DNA –Test dei micronuclei Alterazione del sistema immunitario –Fagocitosi –Conteggio degli emociti –Ossido di azoto –Linfociti –Saggi batterici Alterazioni morfologiche –Stabilità lisosomale –Modifica della struttura dei lisosomi –Proliferazione dei perossisomi –Accumulazione dei lipidi neutri –Accumulazione di lipofuscine

17 gs © 2001-2006 ver 3.0Misure con biomarcatori I17 Biomonitoraggio mediante biomarkers Alterazioni biochimiche –Stress ossidativo Catalasi (CAT) Superossido dismutasi (SOD) Glutatione perossidasi (GPX e Se-GPX), Glutatione reduttasi (GR), Stato redox del glutatione, Glutatione totale (GSH) Perossidazione lipidica –malondialdeide (MDA), Sostanze reattive allacido tiobarbiturico (TBARS) –Biotransformazione e trasporto Enzimi di fase I –Ossidasi a funzione mista Enzimi di fase II –Sistemi di protezione cellulare Metallotioneine (MT) Heat-shock proteins (HSP) –Neurotossicità Inibizione della acetilcolinesterasi (AChE) –Metabolismo energetico

18 gs © 2001-2006 ver 3.0Misure con biomarcatori I18 Utilizzo di risposte sub-letali come biomarcatori Organismi sentinella –Scelta in funzione dellambiente da monitorare Controllo –In siti di controllo –Stabulazione Prelievi –Georeferenziazione –Assenza di stress Analisi –Enzimologia –Tecniche di analisi

19 gs © 2001-2006 ver 3.0Misure con biomarcatori I19 Grazie a… … Bruna Gravina, Irene Tamburin, Christian Asirelli, Federico Caselli, Francesco Ferretti, Giuseppe Giammanco che, nellambito delle loro tesi di laurea in Scienze Ambientali, hanno prodotto testi, immagini, figure e diapositive, utilizzate in questa presentazione. Giorgio Sartor

20 gs © 2001-2006 ver 3.0Misure con biomarcatori I20 Referenze sul WEB Vie metaboliche –KEGG: http://www.genome.ad.jp/kegg/http://www.genome.ad.jp/kegg/ Degradazione degli xenobiotici: http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway/map/map01196.html http://www.genome.ad.jp/kegg/pathway/map/map01196.html Struttura delle proteine: –Protein data bank (Brookhaven): http://www.rcsb.org/pdb/http://www.rcsb.org/pdb/ –Hexpasy Expert Protein Analysis System: http://us.expasy.org/sprot/http://us.expasy.org/sprot/ Prosite (protein families and domains): http://www.expasy.org/prosite/http://www.expasy.org/prosite/ Enzyme (Enzyme nomenclature database): http://www.expasy.org/enzyme/ http://www.expasy.org/enzyme/ –Scop (famiglie strutturali): http://scop.berkeley.edu/http://scop.berkeley.edu/ Enzimi: –Nomenclatura - IUBMB: http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/ –Proprietà - Brenda: http://www.brenda.uni-koeln.de/http://www.brenda.uni-koeln.de/ –Expasy (Enzyme nomenclature database): http://www.expasy.org/enzyme/http://www.expasy.org/enzyme/ Database di biocatalisi e biodegradazione: http://umbbd.ahc.umn.edu/ttp://umbbd.ahc.umn.edu/ Citocromo P450: http://www.icgeb.org/~p450srv/http://www.icgeb.org/~p450srv/ Metallotioneine: http://www.unizh.ch/~mtpage/MT.htmlhttp://www.unizh.ch/~mtpage/MT.html Tossicità degli xenobiotici: Agency for Toxic Substances and Disease Registry http://www.atsdr.cdc.gov http://www.atsdr.cdc.gov

21 Crediti e autorizzazioni allutilizzo Questo ed altro materiale può essere reperito a partire da: http://www1.ambra.unibo.it/giorgio.sartor/ Il materiale di questa presentazione è di libero uso per didattica e ricerca e può essere usato senza limitazione, purché venga riconosciuto lautore usando questa frase: Materiale ottenuto dal Prof. Giorgio Sartor Università di Bologna a Ravenna Giorgio Sartor - giorgio.sartor@unibo.itgiorgio.sartor@unibo.it