presentazione del prof. Ciro Formica

Presentazione sul tema: "presentazione del prof. Ciro Formica"— Transcript della presentazione:

1 presentazione del prof. Ciro Formica
Acidi nucleici - 4 presentazione del prof. Ciro Formica Duplicazione del DNA. Perché la duplicazione è semiconservativa; Come lavorano le DNA polimerasi. Errori durante la duplicazione e modalità di correzione. Descrivere: i meccanismi di duplicazione del DNA il modello a doppia elica di Watson e Crick correlare la sua struttura con le sue funzioni Immagini e testi tratti dai website di: genome.wellcome.ac.uk, dnaftb.org, unipv.it, unimi.it, wikipedia.it, unibs.it, unina.it, uniroma2.it, nih.gov, zanichelli.it, sciencemag.org

2 Duplicazione del DNA proprietà Filamento guida (leading strand) Filamento ritardo (lagging strand) Aggiunta nucleotidi continua (concorde alla forcella) discontinua (opposta alla forcella) Direzione 5’  3’ Okazaki nucleotidi SI Primer (innesco) sintetizzato da RNA primasi Punto di attacco unico numerosi Telomeri 5’-TTAGGG3’ DNA polimerasi proofreading Sul filamento ritardo non si completa l’ultimo frammento di Okazaki, perciò il cromosoma tende ad accorciarsi, ma i TELOMERI, brevi sequenze alle estremità dei cromosomi 5’-TTAGGG3’, proteggono dall’accorciamento, ma solo per duplicazioni cellulari, finché la cellula va in APOPTOSI e muore. L’enzima TELOMERASI sintetizza il DNA telomerico perso durante la duplicazione.

3 Attività enzimatiche della DNA polimerasi
Azione svolta Elicasi Srotola l'elica e taglia i legami a idrogeno tra le basi complementari. Primasi Sintetizza una piccola catena ribonucleotidica (lunghezza 9-10 nucleotidi) -che fa da innesco o primer- necessaria per promuovere l’aggiunta di altri nucleotidi. Polimerasi Aggiunta di 1 nucleotide per volta al 3' OH della catena in accrescimento Ligasi Unisce i frammenti neosintetizzati (dopo la rimozione enzimatica degli RNA-primer). Nucleasi Corregge gli eventuali errori nell'aggiunta dei nucleotidi Nelle nostre cellule la frequenza di errori nell'incorporazione delle basi è minima, dell'ordine di (un errore ogni miliardo – uno ogni 10 miliardi di basi), .

4 DNA polimerasi innesco stampo allungamento catena monomeri primer
template 5’  3’ dNTP

5 replicazione

6 replicazione EDITING: Correzione degli errori durante la duplicazione.

7 replicazione

8 replicazione

9 Bolla di replicazione

10 Meselson e Stahl 1958: Modello semiconservativo
Le molecole di DNA in un gradiente di densità ottenuto centrifugando a lungo una soluzione di CsCl (cloruro di cesio) galleggiano al livello del gradiente che corrisponde alla loro densità. Per distinguerle, le eliche nuove venivano marcate con 14N (azoto leggero, meno denso), le vecchie con 15N (azoto pesante, più denso). Dopo la centrifugazione apparivano dei picchi di densità distinti, che facevano pensare ad una modalità semiconservativa, cioè che ogni doppia elica fosse formata da un’emielica vecchia e una nuova

11 La replicazione semiconservativa: A half DNA ladder is a template for copying the whole
1- incubazione dei batteri in 15N 2- trasferimento in 14N: la crescita prosegue 3- raccolta campioni a 0, 20 (1 replicazione) e 40 minuti (2 replicazioni) 4- si misura la densità delle nuove molecole di DNA: 0’: tutte catene pesanti (15N) 20’: tutte catene intermedie 40’: metà intermedie, metà leggere (14N) Conclusioni: la replicazione non può essere conservativa (2 catene vecchie o 2 catene nuove) né dispersiva (catene miste). Poiché bastano 2 replicazioni per far sparire le catene pesanti, il quadro è compatibile con la replicazione semiconservativa: 1 catena vecchia e 1 nuova).

12 Matthew Meselson, USA, 1930-vivente
Chimico USA, lavorò con Pauling sulle proteine al Caltech. Mediante la cristallografia a r.X evidenziò la struttura proteica. Dimostrò che la ricombinazione dei fagi deriva dallo splicing del DNA. Nel 1960 François Jacob e Sydney Brenner ricavarono nel suo lab al Caltech i dati necessari per dimostrare l’esistenza del mRNA. Scoprì le basi enzimatiche del riconoscimento del DNA interno alla cellula e la protezione mediante aggiunta di gruppi metilici CH3: la metilazione lascia intatto il proprio DNA, mentre il DNA estraneo viene attaccato dagli enzimi di restrizione. Scoprì anche il processo del riparo degli errori di appaiamento del DNA (mismatch repair), che fa fissare gli errori nel DNA. Dal 1963, Meselson si occupa delle armi chimiche e biologiche come consulente di agenzie governative sull’effetto di questi ordigni.

13 Franklin Stahl, USA, 1929-vivente
Conobbe Meselson al corso di biologia molecolare tenuto da Watson e Crick e insieme cercarono di dimostrare la replicazione semiconservativa della DE già ipotizzata dagli stessi Watson and Crick. Lavorarono di comune accordo al Caltech e nel 1957 trovarono le prove sperimentali che cercavano mediante la centrifugazione in gradiente di densità. Dopo la pubblicazione nel ’58 il lavoro fu definito "one of the most beautiful experiments in biology." Ancora oggi insegna all’Università dell’Oregon e si interessa di ricombinazione genetica

14 Arthur Kornberg, USA, Nacque a Brooklyn da genitori dell’Europa Orientale. Fu uno studente prodigio e dopo la laurea in medicina studiò l’ittero epatico, di cui lui stesso soffriva. Fu assunto al NIH, National Institutes of Health dove diresse la sezione di enzimologia e metabolismo, scoprendo un centinaio di enzimi coinvolti nei processi metabolici. In seguito, come direttore di Microbiologia a St.Louis, scoprì la DNA polimerasi I. Fu insignito del Nobel nel ‘59 con Severo Ochoa — Kornberg for the enzymatic synthesis of DNA, Ochoa for the enzymatic synthesis of RNA. Considerava la scienza un’attività creativa, una forma d’arte e ricavò tanta soddisfazione dalla ricerca. La moglie Sylvy era anche lei ricercatrice e lavorò nel suo lab, il figlio Roger anche lui ricercatore isolò la DNA polimerasi III.

15 Sydney Brenner, Sudafrica, 1918-vivente
Per approfondire gli studi di biologia molecolare dovette trasferirsi negli USA, dove collaborò con Watson e Crick. Scoprì l’RNA messaggero e dimostrò in che modo viene determinato l’ordine degli amminoacidi nelle proteine. In seguito ha studiato i geni dei vetrebrati e l’evoluzione del genoma. I suoi studi hanno permesso di analizzare la sequenza dei geni e hanno contribuito alla crescita del Progetto Genoma. Con le sue ricerche sul vermetto Caenorhabditis elegans sono stati meglio compresi l’invecchiamento e la morte cellulare programmata (apoptosi). Nobel nel 2002 con Sulston —per gli studi su morte cellulare programmata e regolazione genica nello sviluppo degli organi

16 Paul Zamecnik, USA, Medico USA, si interessò alla biosintesi delle proteine e dimostrò mediante radionuclidi che per la biosintesi è necessario che gli amminoacidi siano attivati energicamente dall’ATP. Usò un estratto acellulare di fegato di ratto, poi nel 1956 scoprì il fattore di trasporto degli amminoacidi: il tRNA, l’adattatore che Crick aveva previsto nel Dogma centrale: DNA  RNA  PROTEINE. In seguito purificò i tRNA, mentre Nirenberg e Matthaei usarono il suo estratto acellulare di E.coli per ricavare il CODICE GENETICO. Scoprì anche l’mRNA antisenso che blocca la traduzione proteica. Dal 1993 studiò nuovi farmaci basati sull’idea dei bloccanti anti-senso. He passed away in 2009.

17 Marshall Nirenberg, USA, 1927-2010
Zoologo ed ecologista USA, si interessò al CODICE GENETICO. Insieme a Matthaei sintetizzò il primo polinucleotide sintetico, il poliU, dal quale ricavò la fenilalanina: era il primo tassello della decifrazione del CODICE. In seguito sintetizzarono altri polinucleotidi omogenei (poli A, poli,C, poli G) e eterogenei (poli AAG, poli GCC ecc). Scoprì la ridondanza di alcuni amminoacidi (degenerazione del codice) e I “segni di punteggiatura” (codoni INIZIO e STOP). Comprese anche l’universalità del codice per tutte le specie, tranne poche eccezioni. Nobel per la fisiologia e la medicina con Khorana e Holley (il primo a determinare sequenza e struttura di un tRNA). Studiò anche il sistema nervoso della Drosophila, il trasporto degli zuccheri nelle cellule tumorali.

18 Har Gobind Khorana, India-USA, 1922-2011
Biochimico, studiò il codice genetico e partendo dal poli CU ottenne una definitiva dimostrazione del fatto che il codice fosse a triplette. Abbinò la tripletta CUC all’aa. Leucina e UCU alla Serina. Poi proseguì con altre triplette fino alla completa decifrazione del codice. Gli fu assegnato il Nobel con Nirenberg e Holley, per il loro lavoro indipendente "for their interpretation of the genetic code and its function in protein synthesis," In seguito al MIT di Boston riuscì a produrre il primo gene artificiale in un batterio, più tardi sintetizzò il gene della rodopsina, una proteina della retina dell’occhio umano, e a scoprire le mutazioni di questo gene che conducono alla retinite pigmentosa. Il suo lavoro fu fondamentale per i successivi sviluppi dell’ingegneria genetica.

19 mRNA e codice genetico Nirenberg and Khorana did not know the sequence of their synthetic mRNAs. They deduced the sequence by varying the amounts of nucleotides added and calculating the probability of making specific codon sets Perché esiste la ridondanza nel codice genetico, ossia perché il codice è degenerato? Non era preferibile che la natura lasciasse non codificanti i codoni extra? la risposta è più avanti…

20 Il codice genetico UUU Fenilalanina PHE UCU Serina SER UAU Tiroxina
TYR UGU Cisteina CYS UUC UCC UAC UGC UUA Leucina LEU UCA UAA STOP UGA UUG UCG UAG UGG Triptofano TRP CUU CCU Prolina PRO CAU Istidina HIS CGU Arginina ARG CUC CCC CAC CGC CUA CCA CAA Glutammina GLN CGA CUG CCG CAG CGG AUU Isoleucina ILE ACU Treonina THR AAU Asparagina ASN AGU AUC ACC AAC AGC AUA ACA AAA Lisina LYS AGA AUG Codone inizio ACG AAG AGG GUU Valina VAL GCU Alanina ALA GAU Ac.Aspartico ASP GGU Glicina GLY GUC GCC GAC GGC GUA GCA GAA Ac.glutammico GLU GGA GUG GCG GAG GGG

21 Ridondanza o degenerazione del codice genetico
Sono codificati da: 6 codoni - arginina, leucina, serina. 4 codoni – alanina, glicina, treonina, prolina, valina 3 codoni – isoleucina 1 codone – metionina (inizio) e triptofano, 2 codoni – tutti gli altri

22 L’elevata degenerazione del codice può essere interpretata come un meccanismo di protezione contro le mutazioni di singole basi che fanno assumere ad una tripletta un significato diverso da quello originario, compreso il significato di stop. Se una mutazione produce uno stop (probabilità 1/20) è rischioso perché si interrompe la sintesi della proteina. Gi aminoacidi più degenerati sono più frequentemente presenti nelle proteine, quindi più protetti dal rischio di mutazione. Quelli con uno o pochi codoni sono più rari nelle proteine. La terza posizione del codone viene detta posizione di “wobble” (tentenamento). In questa posizione, gli U e le C possono essere letti come G nell’anticodone nel tRNA. Allo stesso modo, le A e le G possono essere lette come U o Y (pseudouridina) nell’anticodone.

23 Se il tRNA contiene una Inosina nell’anticodone in wobble il tRNA può leggere codoni nel mRNA che hanno A, U oppure C nella terza posizione. Nella figura è rappresentato l’esempio della Glicina (Gly)

24 Molecola di tRNA con l’anticodone di riconoscimento del codone di mRNA nel codice genetico.

25 Non sovrapponibiltà delle triplette del codice genetico.

26 Risposta al quesito sulla degenerazione del codice in una proteina.
Gi aminoacidi più degenerati sono più frequentemente presenti nelle proteine, quindi più protetti dal rischio di mutazione. Quelli con uno o pochi codoni sono generalmente più rari nelle proteine. Ser 3 Leu 6 Arg 1 Ala 1 Gly 4 Thr 2 Pro 1 Val 3 Ile 2 Cys 6 (3 ponti S-S) Trp Met