Citogenetica : analisi dei cromosomi NUMERO , MORFOLOGIA e….

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1 Citogenetica : analisi dei cromosomi NUMERO , MORFOLOGIA e….
CROMATINA : contenuto granulare del nucleo (DNA e proteine) - eterocromatina (elementi ripetitivi) - eucromatina (sequenze trascritte) CROMOSOMI : 46 molecole di DNA duplicate e spiralizzate visibili durante la divisione cellulare (metafase) - n° caratteristico per ogni specie - lunghezza e morfologia definite - bandeggio caratteristico con sostanze coloranti (Giemsa, Quinacrine)

2 Cromosoma di Philadelphia (LMC)
1956 Tijo e Levan 46 cromosomi umani 1959 Anomalie di numero trisomia 21: s. di Down 45, X : s. di Turner 47, XXY : s. di Klinefelter 1960 Anomalie di struttura Cromosoma di Philadelphia (LMC) 1968 Caspersson Bandeggio cromosomico Trattamento di cellule in metafase con soluzione ipotonica t(7;11)(p15;p15)

3 PHA Colchicina Linfociti T Blocco in metafase Soluzione ipotonica
FISH (1982) ibridazione fluorescente in situ denaturazione del DNA cromosomico e ibridazione con sonda fluorescente Blocco in metafase Soluzione ipotonica e fissazione

4 Analisi convenzionale del cariotipo
microscopio ottico - bandeggio G

5 numerazione delle bande dal centromero al telomero
Analisi convenzionale (microscopio ottico) ideogrammi p = braccio corto q = braccio lungo numerazione delle bande dal centromero al telomero

6 Analisi convenzionale (microscopio ottico)
Come si riconoscono i singoli cromosomi ? p p Posizione del centromero q q metacentrico acrocentrico

7 Bandeggio G caratteristico
telomero centromero bande G CHIARE ricche in GC molti geni bande G SCURE ricche in AT pochi geni

8 Diverse risoluzioni di bandeggio G
16 bande 24 bande 46 bande Cromosoma 7 risoluzione cariotipo: ( n. bande totali per corredo aploide )

9 Analisi convenzionale (microscopio ottico)
Bandeggio C (eterocromatina) 9 9 1 Notare le grandi regioni eterocromatiche dei cromosomi 1 e 9 1

10 Indicazioni all’analisi del cariotipo
Cariotipo costituzionale : sospetto clinico di patologia cromosomica ritardo di crescita o di sviluppo, facies dismorfica, malformazioni multiple ritardo mentale genitali ambigui o disgenesia gonadica sterilità e coppie con aborti ripetuti storia famigliare positiva per anomalie cromosomiche Aborto spontaneo, morte alla nascita o neonatale Gravidanze con età materna > 35 anni Neoplasie (ematologiche)

11 Anomalie del cariotipo
Anomalie di numero : Trisomie (21, 13, 18, X, Y) Monosomie (45, X) Tri- Tetra-ploidie (3N, 4N con N=23) Anomalie di struttura : Traslocazioni (bilanciate e non) Inversioni, cromosomi ad anello, isocromosomi Delezioni, duplicazioni Sindromi da instabilità cromosomica e siti fragili : Atassia-Telangiectasia, Anemia di Fanconi, S. di Bloom.. X fragile Citogenetica oncologica : Traslocazioni cromosomiche caratteristiche..

12 Incidenza di anomalie cromosomiche da screening neonatali (68
Incidenza di anomalie cromosomiche da screening neonatali ( nati vivi) Totale anomalie = / 154 Tipo di anomalia Incidenza Crom. sessuali in MASCHI / 360 Crom. sessuali in FEMMINE / 580 Aneuploidie degli autosomi 1 / 700 Anomalie strutturali (autosomi, X e Y) 1 / 375 Hsu et al. (1998) in: Milunski A. (ed) Genetic disorders and the fetus.

13 Incidenza di anomalie cromosomiche da screening neonatali (68
Incidenza di anomalie cromosomiche da screening neonatali ( nati vivi) Totale anomalie = / 154 Tipo di anomalia Incidenza Crom. sessuali in MASCHI (43.612) 1 / 360 47,XXY 1 / 1.000 47,XYY 1 / 1.000 altre aneuploidie X o Y 1 / 2.350 Crom. sessuali in FEMMINE (24.547) 1 / 580 45,X 1 / 4.000 47,XXX 1 / 900 altre aneuploidie X 1 / 2.700 Hsu et al. (1998) in: Milunski A. (ed) Genetic disorders and the fetus.

14 Tipo di anomalia Incidenza
Incidenza di anomalie cromosomiche da screening neonatali ( nati vivi) Tipo di anomalia Incidenza Aneuploidie degli autosomi 1 / 700 Trisomia / 830 Trisomia / 7.500 Trisomia / altre aneuploidie 1 / Anomalie strutturali (autosomi, X e Y) 1 / 375 Bilanciate ( Non Robertsoniane ) 1 / 885 Bilanciate ( Robertsoniane ) 1 / 1.100 Sbilanciate ( Non Robertsoniane) 1 / 1.800 Sbilanciate ( Robertsoniane ) 1 / Hsu et al. (1998) in: Milunski A. (ed) Genetic disorders and the fetus.

15 Incidenza di anomalie cromosomiche in stadi diversi di vita fetale e neonatale
aborti feti di madri >35 1° trimestre amniocentesi nati vivi incidenza 1 / 2 1 / 50 1 / 160 Anom. numeriche 96 % 85 % 60 % Anom. strutt. Bilanciate % 30 % Anom. strutt. Sbilanciate 4 % 5 % 10 % Hsu et al. (1998) in: Milunski A. (ed) Genetic disorders and the fetus.

16 Tipo di anomalia % sul totale delle anomalie
Frequenza di anomalie cromosomiche in aborti spontanei con cariotipo anomalo ( su aborti spontanei non selezionati ) Tipo di anomalia % sul totale delle anomalie Aneuploidie Trisomie autosomiche 52 % Monosomie autosomiche < 1% 45,X 19 % Triploidie 16 % Tetraploidie 6 % Altre % Hsu et al. (1998) in: Milunski A. (ed) Genetic disorders and the fetus.

17 Esito di 10.000 concepimenti Aborti spontanei
Concepimenti N % nati vivi Totale % Cariotipo Normale % 8.450 Cariotipo Anomalo % Triploidie / Tetraploidie % ---- 45,X % 1 Trisomia % ---- Trisomia % 1 Trisomia % 10 Altre trisomie % 1 Riarrang. Sbilanciati % 4 47,XXY 47,XXX 47,XYY % 15 Hsu et al. (1998) in: Milunski A. (ed) Genetic disorders and the fetus.

18 Anomalie Cromosomiche
numeriche trisomie (cromosoma aggiuntivo) monosomie (perdita di un cromosoma) poliploidie (multipli di 23 crom. aggiuntivi) ESAC (cromos. anomalo sovrannumerario)

19 Trisomia 13 47, XY, +13

20 CARIOTIPO TRIPLOIDE 69,XXY

21 Trisomia 21 47, XY,+ 21

22 Sindrome di Down (1/800) Facies caratteristica brachicefalia, occipite piatto, collo corto bassa statura, ipotonia mani corte e larghe, piega palmare, clinodattilia ritardo mentale (QI: 30-60) cardiopatie (30-35%), atresia duodenale, fistolaTE rischio aumentato di leucemie prematura senilità, segni Alzheimer-like 95% : trisomie libere (ND materna - meiosi 1: 90%) 4% : traslocazioni robertsoniane rob(14;21) rob(21;22) < 1% : isocromosoma 21, mosaici, trisomie parziali

23 Trisomia 21 libera da NON disgiunzione meiotica
Sindrome di Down: Trisomia 21 libera da NON disgiunzione meiotica 90% dei casi materna 10% dei casi paterna o materna rischio empirico di ricorrenza per la coppia : 1%

24 Incidenza della sindrome di Down
Età materna Alla nascita Amniocentesi Villocentesi ma sett ma set t. /1250 /1400 /1100 30 1/900 33 1/625 1/420 1/370 35 1/385 1/250 1/250 37 1/225 1/150 1/175 40 1/100 1/70 1/80 42 1/65 1/40 1/30 44 1/40 1/25 1/25 Hsu et al. (1998) in: Milunski A. (ed) Genetic disorders and the fetus.

25 Trisomia 21 da traslocazione “robertsoniana” (4%)
Sindrome di Down: Trisomia 21 da traslocazione “robertsoniana” (4%) rob (14;21) rob (21;22) i (21;21)

26

27 Trisomia cromosoma 21

28 Trisomia cromosoma 21

29 Traslocazione robertsoniana: t(13;15)

30 ? Cugina di I° grado con figlia Down,
rischio per la gravidanza in corso ? ? 1% 0.5% 0.25% 0.125% 2% 4% Rara possibilità di Down “ereditario” se trisomia NON libera: R = 4% (rarissimo mosaicismo germinale con RR solo per la coppia) Rischio per età : a 29 anni 1/1100 a 37 anni 1/225

31 A. delezioni B. duplicazioni C. inversioni D. cromosoma
interstiziale terminale tandem invertita paracentrica pericentrica N A N A N A N A N A N A D. cromosoma ad anello E traslocazioni F. sito fragile N A reciproche robertsoniane N N N A A N N A A

32 TRASLOCAZIONE 10q;11q

33 der der

34 Conseguenze delle anomalie cromosomiche di struttura
perdita / acquisizione di materiale genetico monosomie parziali trisomie parziali interessamento di un gene/i nel punto di rottura perdita di funzione di un gene formazione di un gene di fusione difetto di imprinting nessuna conseguenza in termini quantitativi o di funzione genica ma: inattivazione della X normale nelle t (X;A) segregazione sbilanciata alla meiosi o mitosi predisposizione ad ulteriori riarrangiamenti

35

36

37 Sindrome di Miller-Dieker Genitore sano: inv. peric. crom.17
Figlio con M-D: dup (17q), del (17p) Sonde: LIS-1 (17p13.3) RARa (17q12)

38 Caso 510/02 madre

39 PAINTING CROM. 9 510/02

40 Madre a mosaico e unica linea nella figlia
SP510/02

41

42 SONDA BCR(22q11)-ABL(9q34) crom. 9 crom. 22 crom. 22 crom. 9 NEGATIVA

43 presenza di un cromosoma Filadelfia

44 presenza di un doppio cromosoma Filadelfia

45 Sonda: DiGeorge 22q (gene Tuple1) Controllo 22q13.3 (gene ARSA)

46 Sindrome da delezione 22q11.2
3 fenotipi, anche nella stessa famiglia: sindrome di DiGeorge (in neonati): difetto cell. T (ipoplasia timo) ipo-calcemia (ipoparatirodismo) sindrome Velo-Cardio-Faciale (di Shprintzen): anomalie cranio-faciali e del palato bambini con voce nasale Cardiopatia tronco-conale (sindrome di Takao): predominano le anomalie cardiache tetralogia di Fallot, interruzzione arco aortico (tipo B) tronco arterioso, destropos. arco aortico, art. succl. destra aber. Fenotipo “CATCH”: Cardiac Abnormality, T cell defect, Clefting, Hypocalcemia

47 Sindrome da delezione 22q11.2
Incidenza : 1/ nati 5% dei neonati con difetti cardiaci > 40% di Tetralogia di Fallot + atresia v. polmonare > 60% di Tetralogia di Fallot + assenza di v. polmonare 3 Mb delezione sindrome del 22q11.2 duplicazione sindrome “cat eye”

48 Sindrome di Williams Delezione 7q11.23 Sonde: Williams 7q11.23
controllo 7q31

49 Sindrome di Williams-Beuren
Volto caratteristico: ripienezza peri / supra orbitale (specie supero-laterale), sopraciglia e ciglia rade nella regione mediana, gote gonfie ribassate….

50 Volto caratteristico:
…. naso corto con sella nasale schiacciata filtro liscio e lungo iride stellata Difetto cardiaco: stenosi aortica sopra-valvolare Ritardo mentale con personalità estroversa A volte ipercalcemia nell’infanzia sinostosi radio-ulnare (10% dei casi)

51 Delezioni sub-telomeriche

52 Sonda cromosoma- specifica
nucleo in interfase Sonda cromosoma- specifica cromosomi in metafase

53 FISH su nuclei in interfase
Normale Trisomia 21

54 Anomalie cromosomiche multiple (cromos. 1, 3, 6 e 11)

55 Traslocazione complessa 1, 3, 6, 11

56 Traslocazione complessa 1, 3, 6, 11

57 Traslocazione complessa 1, 3, 6, 11

58 “ Chromosome Painting “

59 CGH Cellule tumorali Cellule normali Comparative Genome Hybridization
Estrazione del DNA e marcatura con fluorocromi CGH Comparative Genome Hybridization Identificazione di regioni cromosomiche perse o amplificate Ibridazione metafasi Piastre di cloni genomici