Cenni di Spettroscopia NMR bidimensionale di correlazione Testi consigliati: Stradi, Chiappe (esempi dal Silverstein)

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1 Cenni di Spettroscopia NMR bidimensionale di correlazione Testi consigliati: Stradi, Chiappe (esempi dal Silverstein)

2 A che dimensioni ci riferiamo?? Gli spettri protonici e del C-13 che abbiamo considerato sino ad ora sono grafici delle intensità rispetto alla frequenza: sono quindi grafici a due dimensioni, ma vengono definiti monodimensionali riferendosi alla presenza di una sola dimensione per la frequenza.

3 A che dimensioni ci riferiamo?? Analogamente i cosiddetti spettri bidimensionali sono in realtà dei grafici a tre dimensioni in cui lintensità viene riportata in funzione di due frequenze. Spettro monodimensionaleSpettro bidimensionale

4 Come introduciamo la seconda frequenza?? Negli esperimenti bidimensionali si ripete n volte una certa sequenza di impulsi, ad es: evoluzione acquisizione Impulsi di radiofrequenza In ognuna delle n ripetizioni un parametro di tempo (di solito nellambito del periodo di evoluzione) viene incrementato regolarmente, generando così una risposta che varia nel tempo. n

5 Come introduciamo la seconda frequenza?? Effetto del primo impulso 90 Y : rotazione della magnetizzazione netta di 90° attorno allasse y Andiamo a vedere che cosa succede alla magnetizzazione netta nel piano xy dopo questo impulso e come il suo destino influenza lo spettro

6 Come introduciamo la seconda frequenza?? Analizziamo come varia il segnale di un singoletto (originato ad es. dai protoni dellacetone) al variare del tempo di evoluzione t 1.

7 Come introduciamo la seconda frequenza?? Analizziamo come varia il segnale di un singoletto (originato ad es. dai protoni dellacetone) al variare del tempo di evoluzione t 1. Il secondo pulso agisce soltanto sulla componente di Mxy lungo lasse y.

8 Come introduciamo la seconda frequenza??

9 Mettiamo insieme tutti gli spettri così ottenuti, ordinandoli in funzione del tempo di evoluzione t 1. Adesso abbiamo i dati relativi alla frequenza f 2 (che abbiamo ottenuto attraverso la trasformata di Fourier del FID acquisito in t 2 ) in funzione del tempo di evoluzione t 1.

10 Come introduciamo la seconda frequenza?? La variazione di intensità in funzione di t 1 è periodica e possiamo costruire un pseudo FID analizzando ciascuna delle frequenze di f2 in funzione del tempo t 1.

11 Come introduciamo la seconda frequenza?? Adesso abbiamo una serie di pseudo FID in t 1 (uno per ciascuna frequenza di f2 di cui consideriamo la variazione in t 1 ) e possiamo effettuare su ciascuno di essi una seconda trasformata di Fourier che ci consente di passare da un grafico dellintensità in funzione di f2 e t1 a un grafico dellintensità in funzione di due frequenze, f2 e f1, ottenendo lo spettro NMR 2D.

12 Come introduciamo la seconda frequenza?? In questo caso semplice (e con questo tipo di sequenza di esperimenti multi impulso) osserviamo un unico picco che cade alla stessa frequenza nei due assi, e che quindi si trova lungo la diagonale dello spettro. Nei casi in cui i picchi siano numerosi il tipo di rappresentazione dello spettro 2D mostrato in figura non è utile e si ricorre a dei diagrammi a livelli in cui si rappresentano tutti i picchi generati dall'esperimento visti dall'alto.

13 Come introduciamo la seconda frequenza?? Rappresentazione dello spettro bidimensionale visto dallalto

14 Che informazioni possiamo ottenere dalla seconda frequenza? Nel semplice esempio considerato allo scopo di capire come si possa introdurre una seconda frequenza non abbiamo ottenuto informazioni in più rispetto ad un normale esperimento NMR. In sistemi di spin più complicati, ed eventualmente con sequenze di impulsi più elaborate, durante il tempo di evoluzione t 1 i nuclei interagiscono tra di loro in vari modi e tali interazioni si riflettono nello spettro ottenuto in t 2. f2f2 f1f1 Se effettuiamo su un sistema AX un esperimento simile a quello precedentemente mostrato otteniamo uno spettro di questo tipo (spettro bidimensionale visto dallalto).

15 Che informazioni possiamo ottenere dalla seconda frequenza? Lo spettro 2D si presenta come un diagramma simmetrico in cui entrambi gli assi riportano il chemical shift dei protoni; f 2 cresce come di consueto da destra a sinistra, mentre f 1 cresce dallalto in basso (n.b.: il verso può anche essere opposto) f2f2 f1f1

16 Che informazioni possiamo ottenere dalla seconda frequenza? I normali spettri protonici monodimensionali vengono solitamente riportati sugli assi f1 e f2 per facilitare la lettura del bidimensionale. X f2f2 f1f1 A A X

17 Che informazioni possiamo ottenere dalla seconda frequenza? Dallangolo in alto a destra a quello in basso a sinistra si sviluppa la diagonale che contiene i picchi (in blu) per i quali 1 = 2. Questi picchi non forniscono alcuna informazione addizionale rispetto a quella dello spettro monodimensionale. Fuori diagonale in corrispondenza dei segnali tra i quali si ha accoppiamento si osservano dei picchi (chiamati cross peaks): in uno spettro complesso da questi picchi fuori diagonale possiamo identificare gli shifts di segnali accoppiati! Lo spettro 2D si presenta come un diagramma simmetrico in cui entrambi gli assi riportano il chemical shift dei protoni; f 2 cresce come di consueto da destra a sinistra, mentre f 1 cresce dallalto in basso X f2f2 f1f1 A A X

18 Che informazioni possiamo ottenere dalla seconda frequenza? Con opportune modifiche della sequenza di impulsi che abbiamo visto è possibile ottenere degli spettri 2D che permettono di correlare i segnali di spin accoppiati, sia attraverso legami che attraverso lo spazio, sia nel caso omo che eteronucleare.

19 Correlazioni di shift omonucleari

20 La sequenza di impulsi per un esperimento 1 H- 1 H COSY ( acronimo di COrrelation SpectroscopY) è del tipo considerato nellesempio introduttivo. 1 H- 1 H COSY evoluzione acquisizione Impulsi di radiofrequenza / 2 Il tipo di spettro che si ottiene è quello visto nei lucidi precedenti per il sistema AX.

21 La sequenza di impulsi per un esperimento 1 H- 1 H COSY ( acronimo di COrrelation SpectroscopY) è del tipo considerato nellesempio introduttivo. 1 H- 1 H COSY evoluzione acquisizione Impulsi di radiofrequenza / 2 Lesperimento 1 H- 1 H COSY permette di stabilire la connettività H-H della molecola senza dover necessariamente effettuare una approfondita analisi delle costanti di accoppiamento e degli spostamenti chimici.

22 1 H- 1 H COSY: come leggere lo spettro I picchi contenuti sulla diagonale corrispondono allo spettro monodimensionale. f2f2 f1f1

23 1 H- 1 H COSY: come leggere lo spettro f2f2 f1f1 I picchi contenuti sulla diagonale corrispondono allo spettro monodimensionale.

24 1 H- 1 H COSY: come leggere lo spettro Le macchie simmetricamente disposte al di fuori della diagonale mettono in correlazione due diversi valori di frequenza e quindi due valori diversi di spostamento chimico. Questi cross-peak indicano che i protoni corrispondenti sono accoppiati tra loro. f2f2 f1f1

25 1 H- 1 H COSY: come leggere lo spettro Le macchie simmetricamente disposte al di fuori della diagonale mettono in correlazione due diversi valori di frequenza e quindi due valori diversi di spostamento chimico. Questi cross-peak indicano che i protoni corrispondenti sono accoppiati tra loro. f2f2 f1f1

26 1 H- 1 H COSY: come leggere lo spettro Si inizia la lettura scegliendo un picco di cui si conosce lattribuzione da cui partire per stabilire le correlazioni.

27 1 H- 1 H COSY: come leggere lo spettro In questo caso sappiamo che il metile più schermato è il metile in 7 (il metile 1 è vicino al gruppo carbonilico)

28 1 H- 1 H COSY: come leggere lo spettro Rintracciamo il picco relativo sulla diagonale

29 1 H- 1 H COSY: come leggere lo spettro Tracciamo una retta ortogonale allasse sino a incontrare un cross peak

30 1 H- 1 H COSY: come leggere lo spettro Dal cross peak tracciamo una linea ortogonale alla prima per andare a incrociare sulla diagonale il picco correlato

31 1 H- 1 H COSY: come leggere lo spettro Dal cross peak tracciamo una linea ortogonale alla prima per andare a incrociare sulla diagonale il picco correlato

32 1 H- 1 H COSY: come leggere lo spettro Dal picco sulla diagonale torniamo sullasse delle frequenze ed identifichiamo il picco correlato al 7 che corrisponde ai protoni in 6

33 1 H- 1 H COSY: come leggere lo spettro Dal picco sulla diagonale attribuita agli idrogeni in posizione 6 tracciamo una segmento ortogonale all'asse delle frequenze sino ad incontrare i cross peak

34 1 H- 1 H COSY: come leggere lo spettro Un cross peak è relativo allaccoppiamento con 7, laltro deve essere relativo allaccoppiamento con 5

35 1 H- 1 H COSY: come leggere lo spettro Per identificare sulla diagonale il picco dei protoni in 5 tracciamo un nuovo segmento a partire dal nuovo cross peak

36 1 H- 1 H COSY: come leggere lo spettro Per identificare sulla diagonale il picco dei protoni in 5 tracciamo un nuovo segmento a partire dal nuovo cross peak

37 1 H- 1 H COSY: come leggere lo spettro Per identificare sulla diagonale il picco dei protoni in 5 tracciamo un nuovo segmento a partire dal nuovo cross peak

38 1 H- 1 H COSY: come leggere lo spettro Dal picco dei protoni 5 identifichiamo seguendo la stessa procedura quello dei protoni in 4. Analogamente possiamo operare con laltro semplice sistema di spin.

39 1 H- 1 H COSY: come leggere lo spettro Dal picco dei protoni 5 identifichiamo seguendo la stessa procedura quello dei protoni in 4. Analogamente possiamo operare con laltro semplice sistema di spin.

40 Ipsenolo DQFCOSY: modifica della sequenza COSYin cui vengono rimosse alcune transizioni

41 Correlazioni di shift eteronucleari

42 Correlazione di shift eteronucleari: HETCOR Lesperimento HETCOR permette di correlare lo spostamento chimico dei nuclei 13 C con quello dei protoni ad essi direttamente legati. Negli spettri HETCOR lasse F1, che deriva dallincremento del tempo t 1, è lasse del protone; lasse F2, ottenuto dalla registrazione del segnale nellintervallo t 2, è lasse del carbonio. In questo tipo di spettri non vi è simmetria.

43 HETCOR Tramite questo spettro possiamo attribuire i segnali del carbonio conoscendo lo spettro protone e viceversa. I cross-peaks mettono in correlazione ciascun protone, o gruppo di protoni, con i carboni cui sono direttamente legati.

44 A differenza degli esperimenti HETCOR che prevedono la rivelazione sul canale del 13 C, negli esperimenti HMQC la rivelazione è effettuata sul canale del più sensibile spin protonico. Lo spettro HMQC è molto simile a quello HETCOR e differisce da esso solo per il fatto che gi assi sono invertiti: lasse F1 è lasse del 13 C e lasse F2, ottenuto dalla registrazione del segnale nellintervallo t 2, è lasse del 1 H. Correlazione di shift eteronucleari: HMQC

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