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2 RUOLO DEL LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA
La finalità delle indagini microbiologiche è quella di diagnosticare le infezioni ed accertare i patogeni in causa attraverso indagini dirette (esame colturale) o indirette (ricerca di anticorpi). Un laboratorio di microbiologia deve possedere una particolare attrezzatura che consenta, quando necessario, di poter lavorare in condizioni di sterilità (non contaminazione del campione in esame) e di sicurezza per l’operatore.

3 Cappa a flusso laminare con sistema di sterilizzazione a UV
Tutto il materiale che perviene alla microbiologia viene processato sotto cappa aspirante a flusso laminare. Il flusso laminare ha una doppia funzione: protegge l’operatore da eventuali germi patogeni e protegge il campione in lavorazione da eventuali contaminazioni.

4 Cappa di sicurezza a flusso laminare verticale: la cappa consente la protezione dell’operatore e dell’ambiente dal rischio di contaminazione con agenti microbici e, nello stesso tempo, permette di lavorare in condizioni di sterilità. Un flusso continuo di aria sterile all’interno della cabina, lungo direttrici verticali, impedisce la fuoriuscita verso l’esterno e la penetrazione verso l’interno di contaminanti. La sterilizzazione dell’aria viene realizzata forzandone il passaggio attraverso filtri HEPA in microfibra di vetro che devono essere periodicamente sostituiti. Prima di iniziare il lavoro è necessario azionare la ventilazione per almeno 10 minuti. A fine lavoro devono essere accese le lampade germicide UV di cui le cappe sono dotate: sono lampade costituite da un tubo di quarzo riempito con vapori di mercurio e alla cui estremità sono presenti due elettrodi che determinano il passaggio di corrente all’interno del vapore. Essendo poco penetranti, tali radiazioni vengono utilizzate per il trattamento dell’aria e delle superfici dove i microrganismi sono direttamente esposti alla loro azione.

5 Incubatore o termostato a secco

6 Termostato a secco: è un apparecchio a circolazione di aria calda, dotato di dispositivo di termoregolazione che permette di mantenere costante la temperatura impostata nei vari scomparti con una oscillazione massima di 1°C. E’ uno strumento essenziale in un laboratorio di microbiologia perché la maggior parte dei microrganismi che devono essere ricercati hanno una temperatura ottimale di sviluppo a 37°C. Giara per anaerobiosi: alcuni microrganismi, detti anaerobi obbligati, non sono in grado di riprodursi e di vivere in presenza di ossigeno. Ecco che quindi dobbiamo creare un ambiente privo di tale gas per la loro coltura. Esistono in commercio dei contenitori detti giare, a chiusura ermetica, dove inserendo una busta contenente particolari prodotti chimici, si realizza un’atmosfera con ossigeno < all’1%

7 Microscopio ottico

8 viti e condensatore, le parti accessorie.
Il microscopio composto: comunemente chiamato soltanto microscopio, è un sistema di due lenti convergenti dette rispettivamente obiettivo e oculare. L'oggetto da osservare viene posto davanti all'obiettivo che ne fornisce un'immagine reale capovolta e ingrandita. Questa immagine viene fatta cadere davanti all'oculare a distanza opportuna, che ne dà un'altra, virtuale, ingrandita e capovolta rispetto all’originale Obiettivo ed oculare sono inseriti all'estremità di un tubo metallico della lunghezza standard di 16 cm, appoggiato su un sostegno detto stativo, il quale regge anche il piatto dove viene posto il preparato da osservare. La distanza tra obiettivo e preparato può essere variata con un movimento a cremagliera del tubo, regolato da due viti, quella macrometrica per spostamenti rapidi e quella micrometrica per la messa a fuoco. Con movimenti laterali del piatto si può esaminare la parte del preparato che interessa Le caratteristiche fondamentali di un microscopio ottico sono l'ingrandimento, il contrasto ed il potere di risoluzione. Sotto il piatto si trova il condensatore che fa convergere sull'oggetto la luce prodotta da una lampadina incorporata nel microscopio: il condensatore è munito di un diaframma regolabile. Oculare e obiettivo costituiscono il sistema ottico del microscopio; tubo, piatto, stativo, viti e condensatore, le parti accessorie.

9 Le caratteristiche fondamentali di un microscopio ottico sono l’ingrandimento, il contrasto ed il potere di risoluzione. Ingrandimento Rapporto tra le dimensioni dell’immagine e quella dell’oggetto. Dipende dal prodotto degli ingrandimenti forniti dall’oculare e dall’obiettivo, misurati di solito in diametri. Contrasto Dipende dal diverso assorbimento della luce da parte delle strutture osservate. La maggior parte dei componenti cellulari è trasparente alla luce visibile a causa dell’elevato contenuto di acqua e quindi non visibile al microscopio. Ecco il motivo per cui si effettua una colorazione del preparato con sostanze che si legano in modo selettivo ai componenti delle strutture cellulari, diversificandole. Potere di risoluzione E’ un indice della ricchezza di particolari che si possono osservare in un’immagine. La distanza minima alla quale due punti sono visti come distinti, è detta limite di risoluzione.

10 Ogni campione da sottoporre ad esame colturale viene seminato con un’ansa sterile su diversi tipi di terreno solido a base di agar contenuto nelle cosiddette piastre di Petri. Ogni campione da sottoporre ad esame colturale viene seminato con un’ansa sterile su diversi tipi di terreno solido a base di agar contenuto nelle cosiddette piastre di Petri. Ogni campione da sottoporre ad esame colturale viene seminato su diversi tipi di terreno a seconda del materiale di provenienza e del microrganismo che si intende ricercare.

11 Coltura batterica Tecnica di laboratorio per moltiplicare batteri e altri microrganismi patogeni a scopo diagnostico o sperimentale; l’espressione indica anche l’insieme dei microrganismi che si sono moltiplicati in adatti terreni nutritivi. Terreni di coltura I terreni di coltura, che possono essere liquidi o solidi, tendono a riprodurre l’ambiente naturale in cui i batteri crescono. Il terreno liquido più utilizzato è il brodo di coltura, preparato con infuso di carne bollita, con l’aggiunta dello 0,3% di cloruro di sodio; in esso i batteri crescono producendo intorbidimento. I terreni solidi sono terreni a base di agar, sostanza che solidifica a 45°C, che non è tossica e che non viene metabolizzata dai batteri. Sui terreni solidi i batteri si sviluppano dando origine a colonie isolate.

12 In rapporto alla funzione possiamo parlare di: Terreni arricchiti Sono costituiti da brodo o da agar a cui sono state aggiunte una o più sostanze nutritive e/o anche fattori di crescita  Terreni di arricchimento Contengono sostanze che facilitano la crescita delle specie ricercate a scapito delle altre.  Terreni selettivi Contengono sostanze che, mentre non ostacolano lo sviluppo della specie ricercata, impediscono quello delle altre contenute nel materiale in esame.  Terreni di identificazione In questi terreni sono contenuti rivelatori di attività biochimiche caratteristiche di ciascuna specie batterica. Terreni per anaerobi Contengono sostanze con attività riducente  

13 Tecniche di semina I materiali che pervengono ad un laboratorio di microbiologia clinica sono estremamente vari e la scelta della tecnica di semina appropriata è determinata dalle caratteristiche del campione e dallo scopo per cui vengono predisposte le colture. Senz’altro la tecnica più comunemente impiegata è la semina per striscio: in questo caso si utilizzano piastre , dette piastre di Petri, contenenti un terreno già solidificato. Il prelievo del campione viene effettuato con un’ansa sterile che poi viene strisciata delicatamente sulla piastra in tre direzioni al fine di consentire la crescita di colonie isolate.

14 2 1 3 La tecnica di semina comunemente impiegata per ottenere un buon isolamento delle colonie eventualmente sviluppatesi è quella in tre direzioni.

15 Agar sangue Sabouraud Mac Conkey Sale-mannite Agar cioccolato

16 TERRENI SOLIDI PIU’ COMUNEMENTE IMPIEGATI
Agar-Sangue: è un terreno ricco che permette la crescita praticamente di tutti i batteri Agar-Cioccolato: consente lo sviluppo anche dei batteri più esigenti dal punto di vista nutrizionale Agar-MacConkey: seleziona la crescita dei batteri Gram- ed è contemporaneamente un terreno di identificazione Agar-SaleMannite: contiene una concentrazione salina che inibisce la crescita della maggior parte dei microrganismi tranne lo Stafilococco ed un indicatore per rivelare l’utilizzazione del mannitolo Agar-Sabouraud: consente la crescita selettiva di lieviti e miceti Agar-SS: viene impiegato per la ricerca di Salmonella e Shigella e contiene sali biliari che inibiscono i batteri G+ ed un indicatore che rivela la fermentazione o meno del lattosio

17 Le piastre di semina vengono poi messe ad incubare a 37°C per 24/48 ore a
seconda del materiale in esame e quindi dei microrganismi ricercati.

18 Dopo l’incubazione le piastre di semina vengono “lette” per rilevare l’eventuale crescita batterica.

19 Già dalla piastra di semina è possibile distinguere, nella maggio parte dei casi, colonie di batteri Gram+, di batter Gram- e di lieviti e/o miceti ma per la identificazione di specie è necessaria una serie di prove biochimiche come la fermentazione di alcuni zuccheri, il metabolismo di alcuni aminoacidi, la produzione di particolari enzimi. Prima della automazione tali prove venivano effettuate manualmente testando il microrganismo in esame su vari tipi di terreno e realizzando delle vere e proprie tabelle da cui si poteva risalire alla specie. Un semplice esempio: Batterio Gram negativo Fermentazione del lattosio in aero e anaerobiosi Produzione di gas E.coli Indolo positivo

20 Contemporaneamente viene anche eseguito il test di sensibilità agli antibiotici o antibiogramma sulla base del quale il clinico imposterà la terapia appropriata. La sensibilità di un microrganismo ad un antibiotico viene generalmente espressa come MIC (Minima Concentrazione Inibente): rappresenta la minima concentrazione di farmaco che riesce ad inibire la crescita batterica. A parità di altre caratteristiche come tossicità e capacità di distribuzione nella sede di infezione, il farmaco maggiormente efficace è quello con la MIC più bassa.

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22 Sia le prove biochimiche che i test di sensibilità agli antibiotici oggi vengono eseguiti con strumenti semiautomatici che impiegano dei cosiddetti “pannelli di identificazione e antibiogramma”. Una volta preparata una sospensione batterica a partire da una colonia ben isolata sul terreno di coltura, questa viene inoculata in un “pannello” che poi verrà introdotto in uno strumento che provvederà, dopo opportuna incubazione alla temperatura appropriata, ad effettuare la lettura e la interpretazione dei risultati ottenuti.

23 Inoculo del campione Questo è un pannello: nella parte sinistra vengono realizzate le prove biochimiche necessarie per l’identificazione del germe e nella parte destra viene effettuato il test di sensibilità agli antibiotici.

24 In commercio esistono strumenti come questo che effettuano la lettura sia delle prove biochimiche (reazioni colorimetriche) che delle MIC e forniscono una risposta completa in circa 12 ore. I dati strumentali vengono trasferiti ad un sistema esperto che traduce il valore numerico della Concentrazione Minima Inibente relativa ad ogni antibiotico testato in termini di Sensibile, Intermedio o Resistente. In commercio esistono poi strumenti come questo che effettuano la lettura sia delle prove biochimiche (reazioni olorimetriche) che delle MIC e forniscono una risposta completa in circa 12 ore.

25 Nonostante tutti i progressi della automazione, in microbiologia l’esame batterioscopico resta comunque insostituibile.

26 Esame a fresco   Preparati in goccia pendente ( Vetrino a cellula di Kock ) Microscopio a campo oscuro   Esame previa colorazione Distensione Essiccamento Fissazione Colorazione Lavaggio  Asciugatura Montaggio Osservazione Colorazione semplice Bleu di metilene Colorazione complessa  Colorazione di Gram Colorazione di Ziehl Neelsen ( Microrganismi acido alcool resistenti )

27 LA COLORAZIONE DI GRAM La Colorazione di Gram è la colorazione fondamentale in batteriologia. E' noto che i batteri si dividono in Gram positivi e Gram negativi. Il nome Gram deriva dal batteriologo danese Hans Christian Gram che sviluppò questo metodo di colorazione nel 1884.

28 Membrana citoplasmatica
PRINCIPALI DIFFERENZE NEGLI INVOLUCRI ESTERNI DEI BATTERI GRAM– E GRAM + Peptidoglicano Membrana citoplasmatica Periplasma Membrana esterna

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32 Il tempo necessario per la colorazione di un preparato è generalmente intorno alla mezz’ora, il tempo per una identificazione completa è di circa ore. Ci sono situazioni in cui (sepsi) poter dire che l’infezione in atto è dovuta ad un batterio G- o G+ in tempi brevissimi è di fondamentale importanza per la cura del paziente in quanto la sensibilità ai chemioterapici delle due classi di microrganismi è molto diversa. Inoltre anche nella normale routine, ogni volta che dall’esame delle colonie sviluppatesi sulla piastra di semina non si riesce a dare un preciso indirizzo per l’identificazione, un semplice vetrino colorato col metodo di Gram aiuta il microbiologo ed accorcia i tempi di risposta.

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34 Quali di questi strumenti sono necessari in un laboratorio di microbiologia:
Cappa a flusso laminare Bagnomaria termostatato Termostato a temperatura controllata L’Agar-Sangue è: Un terreno selettivo Un terreno ricco Un terreno di identificazione

35 Il risultato dell’esame batterioscopico che permetta di distinguere se il
batterio agente etiologico dell’infezione è un Gram+ o un Gram- è utile: Al microbiologo per impostare il percorso per la identificazione completa del batterio Al clinico per iniziare, in caso di necessità, una terapia antibiotica precoce Ad entrambe le figure professionali

36 L’antibiotico di prima scelta è sempre quello:
Con la MIC più bassa indipendentemente dalla sede di infezione Meno tossico Meno tossico con la MIC più bassa Nessuna delle tre risposte è completa: l’antibiotico di prima scelta deve avere una MIC bassa, essere meno tossico possibile ed essere in grado di raggiungere una idonea concentrazione nella distretto interessato dall’infezione.

37 Il potere di risoluzione di un microscopio è definito come:
Il diverso assorbimento della luce da parte delle diverse strutture cellulari Un indice della ricchezza di particolari che si possono osservare in un’immagine

38 LA FASE PREANALITICA IN MICROBIOLOGIA
Rappresenta un momento cruciale nell’ambito del processo di Laboratorio, durante la quale si compie il 46% degli errori Rappresenta un fondamentale momento di interfaccia tra il laboratorio e le altre parti interessate al processo Laboratorio Analisi U.O.S. Microbiologia

39 RACCOLTA DEL CAMPIONE Il campione deve provenire dalla zona dove è in atto l’infezione Si devono stabilire i periodi ottimali per la raccolta del campione per avere maggiore possibilità di isolamento dei microrganismi patogeni Si deve prelevare una quantità di materiale sufficiente per permettere l’esecuzione delle tecniche di coltura richieste Si devono impiegare contenitori idonei onde garantire un isolamento ottimale dei microrganismi Quando sia possibile, il prelievo deve essere effettuato prima dell’inizio della terapia antibiotica

40 Il campione biologico:
rappresenta senza ombra di dubbio il punto cruciale per la qualità del referto emesso: solo se vengono rispettate le modalità di prelievo, trasporto e conservazione si può garantire un risultato corretto

41 Solo la stretta collaborazione tra tutte le figure coinvolte a diverso titolo nell’indagine microbiologica ed il rispetto in tutte le fasi delle corrette procedure può assicurare la piena attendibilità dell’indagine microbiologica e conseguentemente consentire la messa in atto della terapia adeguata.

42 IDENTIFICAZIONE DEL CAMPIONE
Tutti i contenitori inviati devono essere identificati in maniera inequivocabile (nome, cognome e data dinascita, etichetta con codice a barre etc.) : una cosa apparentemente ovvia ma spesso trascurata e che inficia tutto il percorso precedente.

43 Cosa deve fare il Laboratorio?
Definire precise linee guida sulle modalità di prelievo, conservazione e trasporto specifiche per ogni tipo di campione Monitorare la loro osservanza e applicazione