ANALISI ENZIMATICA DOSAGGI ENZIMATICI

Presentazione sul tema: "ANALISI ENZIMATICA DOSAGGI ENZIMATICI"— Transcript della presentazione:

1 ANALISI ENZIMATICA DOSAGGI ENZIMATICI
determinazione dell’ attività catalitica di enzimi determinazione della concentrazione di sostanze per mezzo di enzimi determinazione della concentrazione di sostanze mediante reattivi marcati con enzimi

2 Struttura generale degli enzimi
Zimogeno (precursore) DNA RNA ribosomi Substrato Prodotto ENZIMA ATTIVO Sito attivo Apoenzima Parte non-proteica ione metallico o coenzima Ubiquitina Lisosomi degradazione Sito allosterico Effettore allosterico

3 ENZIMI Gli Enzimi sono macromolecole biologiche di natura proteica con gruppi funzionali sui quali hanno luogo scambi o trasformazioni di sostanze. Gli Enzimi sono catalizzatori biologici. X G DG Y Reazione non catalizzata DG* DG* Reazione catalizzata

4 Cinetiche chimiche (AP)
Concentrazione di prodotto Tempo Vt Equilibrio V iniziale k=costante di velocità n=numero intero 1-3

5 Effetto della concentrazione di A (A  P)
[prodotto] Tempo A1 [A] Velocità iniziale A1 A4 A4 A3 A2 A3 A2

6 Cinetiche chimiche vs cinetiche enzimatiche
Velocità iniziale [A] Cinetica enzimatica Cinetica chimica

7 Ipotesi per l’azione degli enzimi
E + S  ES  EP  E + P Grafico di Lineweaver-Burk V0 1/V0 Vmax Vmax/2 1/Vmax KM [S] 1/KM 1/[S]

8 EQUAZIONE DI MICHAELIS-MENTEN
L’equazione vista in precedenza, che descrive la relazione velocità-concentrazione di substrato in una reazione enzimatica, è l’equazione di Michaelis-Menten Come già detto, Vmax è la velocità dello stadio limitante della reazione enzimatica ad alte concentrazioni di substrato, quindi Vmax = k2[ES] Ad alte concentrazioni di substrato l’enzima è saturato, perciò [ES] = [E], da cui Vmax = k2[E] L’equazione può essere scritta in una forma diversa che evidenzia la dipendenza della velocità, oltre che dalla concentrazione di substrato, dalla concentrazione di enzima k k2 E + S ES E + P k-1

9 Velocità della reazione
Regione 1 1 2 3 Velocità della reazione 1° ordine > La velocità di reazione è direttamente proporzionale a [S] Regione analitica per la determinazione della concentrazione del substrato Regione 2 Regione non utile dal punto di vista analitico intermedie ordine misto v  Regione 3 << ordine 0 Regione analitica per la determinazione della attività enzimatica

10 Nomenclatura degli enzimi
Denominazione classica costituita da 3 parti: Nome del substrato Nome del coenzima Nome della reazione catalizzata + “asi” Esempio: Lattico-NAD-deidrogenasi International Enzyme Commission, fondata nel 1956 da Prof. M. Florkin, International Union of Biochemistry: Classificazione degli enzimi secondo il sistema delle classi EC Esempi: Creatin kinasi: EC , adenosintrifosfato : creatin N-fosfo trasferasi Lattato deidrogenasi: EC , lattato : NAD+ ossidoreduttasi Ha funzionato bene fino agli anni ‘90 (circa 3200 enzimi) Progetto genoma umano (HUGO): Esistono circa 20,000 geni, di cui almeno 1/4-1/3 sono enzimi

11 Classificazione internazionale degli enzimi
1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 1.1 agisce sul gruppo CHOH del donatore 1.2 agisce sul gruppo aldeidico o chetonico del donatore 1.3 agisce sul gruppo CH-CH del donatore 1.4 agisce sul gruppo CH-NH2 del donatore 1.5 agisce sul gruppo C-NH del donatore 1.6 agisce su NADH2 o NADPH2 1.7 agisce su altri composti azotati 1.8 agisce su gruppi solforati 1.9 agisce sui gruppi eme

12 Classificazione internazionale degli enzimi
1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 2.1 gruppi ad una unità di carbonio 2.2 gruppi chetonici o aldeidici 2.3 gruppi acilici 2.4 gruppi glicosidici 2.5 gruppi alchilici 2.6 gruppi azotati 2.7 gruppi fosforici 2.8 gruppi contenenti zolfo

13 Classificazione internazionale degli enzimi
1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 3.1 legami esterei 3.2 legami glicosidici 3.3 altri legami 3.4 legami peptidici 3.5 legami C-N non peptidici 3.6 legami anidridici 3.7 legami C-C

14 Classificazione internazionale degli enzimi
1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami 4.1 legami C = C 4.2 legami C = O 4.3 legami C = N 4.4 legami C = S

15 Classificazione internazionale degli enzimi
1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami 5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo isomero 5.1 racemasi 5.2 cis-trans isomerasi

16 Classificazione internazionale degli enzimi
1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami 5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo isomero 6 - ligasi: reazioni di formazione di nuovi legami con rottura di ATP in AMP e pirofosfato o ADP e Pi 6.1 legami C-O 6.2 legami C-S 6.3 legami C-N 6.4 legami C-C

17 Classificazione internazionale degli enzimi
1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione 2 - transferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami 5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo isomero 6 - ligasi: reazioni di formazione di nuovi legami con rottura di ATP in AMP e pirofosfato o ADP e Pi

18 Classificazione enzimi plasmatici
Enzimi specifici del plasma Enzimi non specifici del plasma Enzimi secreti Enzimi del Metabolismo intracellulare Enzimi della coagulazione Enzimi presenti nei tessuti

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21 NOMENCLATURA

22 CLASSIFICAZIONE EMPIRICA
Significato della presenza di enzimi intracellulari nel plasma Aumento del turnover cellulare Proliferazione cellulare (neoplasia) Aumento di sintesi enzimatica (induzione) Lesione di un tessuto Ostruzione della secrezione Diminuzione della eliminazione (clearance) Concentrazione degli enzimi nel plasma dipende da: sintesi dell’enzima stato d’integrità delle membrane cellulari fenomeni di distribuzione velocità di eliminazione

23 Alcuni enzimi del plasma
Enzima Organo Cause di aumento Note Fosfatasi alcalina (ALP) Fegato, osso, placenta, epitelio intestinale Gravidanza, infanzia Osteomalacia, cirrosi epatica, Tumori ossei, iperparatiroidismo, fratture, infiammazione intestinale Isoenzimi identificabili per elettroforesi Fosfatasi acida Prostata Tumore prostatico Enzima labile Aspartato transami-nasi (AST o GOT) Fegato e miocardio Epatite/necrosi epatica, Infarto, traumi, malattie muscolari, epatite cronica Fisiologico in neonati Normale: ALT<AST Epatite: ALT>AST Gamma glutamil transferasi (GGT) Fegato, rene, pancreas Colestasi epatica Epatite, cirrosi, pancreatite Ingestione di alcool o farmaci, insufficienza cardiaca Marker di sindromi epatobiliari Creatin chinasi (CK) Distrofia muscolare, infarto del miocardio BB cervello MB cuore MM muscolo Amilasi Ghiandole salivari, pancreas Pancreatite, ulcera duodenale, ostruzione intestinale, chetoacidosi diabetica, calcoli o infiammazione delle ghiandole salivari Lattato Deidrogenasi (LDH) Isoenzimi danno indicazioni più specifiche Alanina Transaminasi (ALT o GPT) Fegato Aumenta in epatiti e cirrosi Colineste-rasi Livello basso indica disfunzione epatica

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25 UNITA’ DI MISURA

26 Enzimi plasmatici a scopo diagnostico
SAGGI ENZIMATICI IN CLINICA Enzimi plasmatici a scopo diagnostico Carenze/difetti enzimatici responsabili di sindromi biochimiche CONDIZIONI SPERIMENTALI DEL SAGGIO Controllo del pH con una soluzione tampone Controllo della temperatura Assenza di inibitori (agenti chelanti, metalli)

27 SAGGI DI ATTIVITA’ ENZIMATICA
Metodi spettrofotometrici Metodi fluorimetrici Metodi potenziometrici (pH) Metodi manometrici Metodi radioisotopici Metodi continui Metodi discontinui Metodi accoppiati

28 Una reazione enzimatica è un processo cinetico, perciò un parametro importante nella misura di attività enzimatica è il tempo La velocità è definita come variazione di concentrazione del prodotto nel tempo Quindi, la velocità è data dalla pendenza di questa curva tempo [P] 1 2 La pendenza della curva (velocità) varia nel tempo La misura di velocità deve essere effettuata ad un tempo ben preciso, nell’intervallo in cui si osserva una relazione lineare tra [P] e tempo, quindi nelle fasi iniziali della reazione tempo velocità La misura di attivita’ enzimatica e’ una misura di velocita’ iniziale della reazione La velocità iniziale si indica con v0 oppure vi

29 DETERMINAZIONE ATIVITA’ ENZIMATICA
Da misure di assorbanza: Al tempo t1 si avrà A1= ε• l• c1 A2 tempo t2 si avrà A2= ε• l• c2 Al–A2= ε• l(c1– c2) c= A/ε l E= (mmol di substrato/VDt)= Dc’/Dt E=(DA/elDt)103 Ecampione=E(V/v) v=volume campione

30 E + S  E + P (prodotto colorato - cromoforo
SAGGI CONTINUI SAGGI DIRETTI E + S  E + P (prodotto colorato - cromoforo o fluorescente – fluoroforo) Esempio: + NADH Piruvato Lattato Deidrogenasi (LDH) + NAD+ Lattato

31 E’ la reazione indicatrice piu’ impiegata in spettrofotometria
TEST OTTICO DI WARBURG NAD NADH N + R H 2 O .. + H+ + 2e- + H+ deidrogenasi A + +B 260 340 E’ la reazione indicatrice piu’ impiegata in spettrofotometria indiretta per applicazioni cliniche: Massimi di assorbanza separati permettono misure cinetiche

32 E1 + S  E1 + P (prodotto non colorato o fluorescente)
SAGGI CONTINUI SAGGI ACCOPPIATI E1 + S  E1 + P (prodotto non colorato o fluorescente) E2 + P  E2 + Q (secondo prodotto, Q, colorato) L-treonina aldolasi Esempio: + L-treonina glicina acetaldeide alcol deidrogenasi + NADH + NAD+ acetaldeide alcol etilico ACCOPPIAMENTO CON REAZIONE IRREVERSIBILE E1 E2 A B  C

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34 [Etot] = 0,13 mM Vmax = 26  0,3 mM min-1 KM = 0,19  0,01 mM kcat = Vmax / [Etot] = 26 / 0,13 = 206 min-1

35 TEST OTTICO DI WARBURG L’attività enzimatica delle ossidoreduttasi che utilizzano (consumano o producono) NAD(P)H come cofattore può essere determinata direttamente perché il NAD(P)H ha un massimo di assorbimento caratteristico a 340 nm che non si trova nel cofattore in forma ossidata NAD(P)+ Altrimenti si usano metodi colrimetrici che sfruttano la riduzione dei Sali ditetrazolio a formazani rossi porpora. Il NAD(P)H può essere misurato anche in fluorescenza, con un massimo di eccitazione a 340 nm ed un massimo di emissione a 460 nm Vantaggi: più basso limite di rivelazione teorico Svantaggi: interferenze della matrice che producono un alto segnale di fondo Tra le deidrogenasi NAD e NADP dipendenti di interesse Clinico: sorbitolo deidrogenasi, malato deidrogenasi, Glucosio 6-fosfato deidrogenasi eritrocitaria, piruvato chinasi.

36 Misura mediante derivati chimici
Sali di tetrazolio Composti cromogenici che vengono ridotti a formazani caratterizzati da valori elevati del coefficiente di assorbività molare e N R3C NR2 N+R1 Cl- CR3 R2N + N N+ Rx Ry 2Cl- Sale monotetrazolico Sale ditetrazolico R = gruppi aromatici

37 Misura mediante derivati chimici
Sali di tetrazolio Esempio: alcol deidrogenasi Etanolo Acetaldeide NAD+ NADH + H+ PMS PMSH Prodotto di riduzione (formazano) Sale di tetrazolio PMS = fenazina metasolfato Alcol deidrogenasi Il valore di e dei formazani è 2-4 volte più alto di quello del NAD(P)H, perciò si ottengono limiti di rivelazione 2-3 volte più bassi (A = ebc)

38 SAGGI DISCONTINUI E1 + S  E1 + P P-X metodi colorimetrici
PRELIEVO DI ALIQUOTE AD INTERVALLI DI TEMPO ENZIMA + SUBSTRATO REAZIONE IN CORSO E1 + S  E1 + P P-X metodi colorimetrici Quantificazione con HPLC Trasformazione in un composto che può essere quantificato colorimetricamente o in altro modo 1a FASE 2a FASE X E2 Metodi radioisotopici

39 MISURE CINETICHE O END-POINT
Determinazione di Plasminogeno nel sangue umano citralato 1.Plg + SK/Fib (eccesso) → (Plg • Sk/Fib) (Plg • Sk/Fib) 2. Substrato Plg → Peptide + pNA Rilascio di p-nitroanilina misurato a 405 nm è proporzionale al Plg nel plasma Aggiungere nei pozzetti della micropiastra: Campioni/controlli/standard diluiti 50 μL Incubare a 37°C per 3-4 minuti Reagente Streptochinasi (pre-riscaldato a 37°C) 50 μL Miscelare e incubare a 37°C per 3 minuti Substrato cromogenico (pre-riscaldato a 37°C) 50 μL A. Metodo cinetico: leggere il ΔA/min a 405 nm per secondi. B: Metodo end-point: procedere come seque: Acido acetico al 20% o acido citrico al 2% 50 μL Miscelare

40 enzimi attivi nel plasma (fattori della coagulazione)
ENZIMI PLASMATICI DA DOSARE enzimi attivi nel plasma (fattori della coagulazione) enzimi attivi in fluidi extra-cellulari (ad esempio, enzimi digestivi) enzimi del metabolismo cellulare ubiquitari organo (tessuto)-specifici

41 variazione della quantità di tessuto
VARIAZIONE ENZIMI PLASMATICI DOVUTE A : Alterata sintesi variazione della quantità di tessuto variazione nella permeabilità cellulare Alterazione nella velocità di inattivazione/ degradazione Ostruzione di una normale via di escrezione Altri fattori (inibitori, carenza di cofattori...)

42 Gli enzimi non hanno una struttura omogenea
ISOENZIMI Gli enzimi non hanno una struttura omogenea Isoenzimi: proteine che catalizzano la stessa reazione e presentano diverse proprietà molecolari e/o diverse proprietà funzionali -METODI NON SELETTIVI -METODI SELETTIVI

43 METODI DI STUDIO DI ISOENZIMI
METODI NON SELETTIVI Metodi elettroforetici Metodi cromatografici Metodi di elettrofocalizzazione

44 METODI DI STUDIO DI ISOENZIMI
METODI SELETTIVI Inibizione chimica Ioni metallici, fluoruri, etanolo, solventi organici,… Inibizione fisica Determinazione degli isoenzimi della fosfatasi alcalina e lattato deidrogenasi Inibizione immunologica Anticorpi Reattività selettiva verso un substrato Determinazione di LDH1

45 Infarto miocardico

46 ISOENZIMI Isoenzimi della lattato deidrogenasi LDH: LDH1 4 subunità H LDH2 3 subunità H e da una M (H3M) (miocardio, eritrociti, rene e polmone) LDH3 (H2M2) (milza, pancreas, tiroide, linfonodi) LDH4 (HM3) LDH5 (M4) (fegato e muscoli scheletrici)

47 Diagnosi differenziale di infarto del miocardio e epatite acuta
ISOENZIMI Diagnosi differenziale di infarto del miocardio e epatite acuta

48 Esochinasi (HK) e glucochinasi (GK) Glucosio + ATP  Glucosio-6-fosfato + ADP
glucosio in sangue: 5 mM, intracellulare: mM Muscolo: HK Inibita da Glucosio-6-fosfato Utilizzo di glucosio indipendente da glucosio in sangue Epatociti: GK Non inibita da Glucosio-6-fosfato Trasformazione di glucosio in glicogeno dipendente da glucosio in sangue Pancreas: GK Sensore di glucosio in sangue per la produzione di insulina

49 Isoenzimi della Fosfatasi Alcalina

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51 Rappresentazione grafica delle reazioni enzimatiche
Grafico di Lineweaver-Burk V0 1/V0 Vmax Vmax/2 1/Vmax KM [S] 1/KM 1/[S]

52 Inibizione competitiva
INIBITORI Inibizione competitiva I simile a S, compete con S per il sito attivo di E Inibizione reversibile all’aumentare di [S] Vmax non cambia, KM aumenta [S] v0 1/[S] 1/v0 Vmax  inibitore  inibitore  KM Vmax/2  1/KM 1/Vmax

53 Inibizione non competitiva
INIBITORI Inibizione non competitiva I reagisce su un sito diverso dal sito attivo Tende a disattivare E Inibizione non reversibile all’aumentare di [S] KM non cambia, Vmax diminuisce [S] v0 1/[S] 1/v0  inibitore  inibitore Vmax  1/Vmax KM Vmax/2 1/KM

54 Inibizione uncompetitiva
INIBITORI Inibizione uncompetitiva L’inibitore reagisce con il complesso ES Cambiamenti simultanei di KM e Vmax 1/KM Vmax [S] KM 1/[S] 1/V0 1/Vmax V0 + inibitore + inibitore

55 DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI
Gli enzimi non sono l’oggetto dell’analisi, ma vengono utilizzati come “strumenti” analitici per determinare la concentrazione degli analiti di interesse Vantaggi L’elevata specificità degli enzimi per i loro substrati consente spesso l’analisi diretta dei campioni biologici, senza o con poche e semplici fasi di estrazione e purificazione L’elevato potere catalitico degli enzimi fa sì che i metodi enzimatici siano caratterizzati da bassi limiti di rivelazione, il che rende sufficienti volumi molto piccoli di campione Maggiore rapidità Maggiore accuratezza Risparmio di reagenti Prelievo di piccoli volumi di fluidi biologici

56 DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI ANALITI
METODI A PUNTO FINALE Semplici accoppaiti

57 METODI A PUNTO FINALE SEMPLICI
È sufficiente una sola reazione enzimatica per la determinazione della concentrazione dell’analita di interesse S Eind. P Condizioni sperimentali Enzima indicatore in eccesso pH e Temperatura ottimali Queste condizioni non sono sufficienti per garantire che il substrato venga consumato completamente

58 METODI A PUNTO FINALE ACCOPPIATI
È necessario accoppiare alla prima reazione enzimatica una o più reazioni enzimatiche per la determinazione della concentrazione dell’analita di interesse S Eaus. P1 Eind. P2 Condizioni sperimentali Enzimi indicatore ed ausiliario in eccesso pH e Temperatura ottimali La reazione indicatrice svolge anche la funzione di rimuovere continuamente i prodotti di reazione man mano che si formano, garantendo lo spostamento verso destra della reazione ed il consumo completo del substrato

59 ANALISI ENZIMATICA DI SUBSTRATI
Determinazione dell’etanolo nel siero del sangue: CH3-CH2-OH + NAD+  CH3CHO + NADH + H+ Alta concentrazione di NAD+, un alto pH o si accoppia la reazione ad una reazione irreversibile: + H2O semicarbazide semicarbazone

60 ANALISI ENZIMATICA DI SUBSTRATI
FASE PRE-ANALITICA Tipo di campione Possono essere utilizzati siero, plasma (con EDTA, citrato, fluoruro/ossalato o eparina) oppure urina. Non utilizzare alcool come disinfettante durante la raccolta o la conservazione dei campioni ematici. Raccogliere campioni di urina in contenitori puliti di plastica o vetro. Centrifugare i campioni di urina che, prima dell’analisi, appaiono molto torbidi. Tappare ermeticamente i campioni per evitare l’evaporazione di alcool. Precauzioni Per i campioni di urina al di fuori del normale intervallo previsto per il pH urinario o al di sotto della normale concentrazione di creatinina nell’urina si deve sospettare un’adulterazione. Un’adulterazione del campione di urina può portare a risultati errati. Se si sospetta un’adulterazione del campione, prelevare un altro campione. I campioni umani devono essere maneggiati e smaltiti come campioni potenzialmente infetti. Conservazione I campioni di siero e di plasma possono essere conservati per 14 giorni a °C o a 2…8°C con o senza conservante, per periodi di conservazione superiori, congelati a –20°C. Si raccomanda di usare campioni di urina prelevati di recente. Se non vengono analizzati immediatamente, i campioni di urina possono essere conservati per almeno una settimana a 2…8ｰC, per periodi di conservazione superiori, congelati a –20ｰC. Tappare ermeticamente i campioni per evitare l’evaporazione di alcool. Misurare i campioni immediatamente dopo il loro inserimento nell’analizzatore.

61 ANALISI ENZIMATICA DI SUBSTRATI
FASE ANALITICA E POST-ANALITICA Per le procedure automatiche consultare il manuale d’uso e le note applicative dell'analizzatore Konelab. Tutte le applicazioni non esplicitamente approvate da Thermo Electron Oy, non possono essere garantite in termini di prestazioni e dovranno pertanto essere valutate dall'utilizzatore. Materiali inclusi nel kit I reagenti sopra descritti. Materiali necessari ma non inclusi nel kit Calibratori e controlli indicati di seguito. Calibrazione Il set contiene: 1 x 5 ml Livello E0, calibratore negativo 1 x 5 ml Livello E1, 1.0 g/l (100 mg/dl) alcool etilico. Se inutilizzati, i calibratori devono essere chiusi ermeticamente e refrigerati a una temperatura di 2…8ｰC per evitare l’evaporazione di alcool. Calibrare il metodo immediatamente dopo l’inserimento dei calibratorinnell’analizzatore.Tracciabilità: Fare riferimento all'inserto nella confezione dei calibratori. Controllo di qualità Utilizzare i campioni del controllo di qualità almeno una volta al giorno, dopo ogni calibrazione e ogni volta che si utilizza un nuovo flacone di reagente. Controlli disponibili: Set controllo E DoA, codice Il set contiene: 1 x 5 ml Livello 1 E, 0.5 g/l (50 mg/dl) alcool etilico 1 x 5 ml Livello 2 E, 3.0 g/l (300 mg/dl) alcool etilico Se inutilizzati, conservare i controlli ermeticamente chiusi e refrigerati a 2…8ｰC per evitare l’evaporazione di alcool. Misurare i controlli immediatamente dopo il loro inserimento nell’analizzatore. Gli intervalli e i limiti del controllo devono essere adattati ai requisiti dei singoli laboratori. I risultati dei campioni del controllo di qualità devono rientrare nei limiti di variabilità stabiliti a priori dal laboratorio. CALCOLO DEI RISULTATI I risultati vengono calcolati automaticamente dall’analizzatore Konelab in base ad una curva di calibrazione.

62 FASE ANALITICA E POST-ANALITICA
INTERVALLO DI MISURAZIONE g/l ( mg/dl) I campioni con una concentrazione alcolica superiore a 3.5 g/l o 350 mg/dl possono essere diluiti con il calibratore negativo E0. Ripetere il dosaggio e moltiplicare il risultato per il fattore di diluizione per ottenere la concentrazione effettiva. Limite di rilevabilità 0.1 g/l (10 mg/dl) Il limite di rilevabilità rappresenta la più bassa concentrazione misurabile quantitativamente. Imprecisione

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64 Metodo di confronto Sono stati eseguiti studi comparati utilizzando un analizzatore Konelab 60 e i seguenti metodi come riferimento (x): 1) Siero: Metodica enzimatica disponibile in commercio (x) regressione lineare (g/l): y = 1.03x – 0.02 r = 0.997 n = 60 Le concentrazioni del campione erano comprese fra 0 e 3.0 g/l. 2) Urina: Metodica GC disponibile in commercio (x) Regressione lineare (g/l): y = 0.93 x – 0.02 r = 0.992 n = 47 Le concentrazioni dei campioni erano comprese tra 0 e 2.7 g/l (GC). I risultati ottenuti nei singoli laboratori possono differire dai dati sulle prestazioni riportati. Specificità Sono stati testati per cross-reattività nel dosaggio vari composti organici strutturalmente correlati.

65 ANALISI ENZIMATICA DI SUBSTRATI
Determinazione della concentrazione di glucosio nel siero del sangue: GLUCOSIO OSSIDASI b-D-glucosio + O2  D-gluconolattone + H2O2 PEROSSIDASI H2O2 + ABTS + 2H+  ABTSossidato H2O (incolore) (assorbe a 610 nm) ABTS (2,2’-azino-di[3-etilbenzotiazolina acido solfonico])

66 Rapid Enzymatic Tests for Glucose
  Introduction: Reagent strips have been designed to perform rapid and semi-quantitative analysis for glucose. They are easy to use and require no addition laboratory equipment of reagents. Three reagent strips, Clinistix, Dextrostix and Diastix, will be used. The enzymatic reactions involved are as described below. Step 1: Glucose Glucose Oxidase Glucose > Gluconic Acid + H2O2 Step 2: Clinistix and Dextrostix: H2O2 + chromogen orthotolidine- Peroxidase H2O2 + chromogen orthotolidine > oxidized orhotolidine Diastix: H2O2 + Potassium iodide ---Peroxidase H2O2 + Potassium iodide > iodine complex     The intensity of the color gives a semi-quantitative analysis of the level of glucose in the samples. Materials: Please refer to class notes and p b of the Laboratory Manual  .   Bottles of Reagent Strips Instead of blood and urine samples, Sample Solutions A, B, and C will be used Procedure: Clinistix:  · Immerse reagent area with sample solution - start timing · Tap edge to remove excess solution · After exactly 10 seconds, compare to colour chart provided Dextrostix:  · Add a drop of sample solution to the test strip · After exactly 60 seconds, wash with water for 2 second (water bottle) · Blot once gently · Compare to colour chart immediately Diastix:  · Immerse reagent area with sample solution - start timing · Tap edge to remove excess solution · After exactly 30 seconds, compare to colour chart

67 ENZIMI IMMOBILIZZATI UN ESEMPIO: GLUCOMETRO

68 Esempi di glucometri Test invasivi Test non invasivi

69 Esempi di glucometri Tipo di Test: glicemia su sangue intero capillare
metodo: elettrochimico enzima: glucosio ossidasi sistema di riferimento: sangue intero Campione di sangue: 2 µL (microlitri) Intervallo di misura: mg/dL * Tempo di analisi: 30 secondi Memoria: 20 risultati memorizzati (glicemia e test di controllo) Nota: se in memoria sono già presenti 20 risultati e ne viene aggiunto uno nuovo, il risultato più vecchio viene automaticamente cancellato. Temperatura di lavoro: 10° - 40°C Umidità ambientale: % (umidità relativa) Programmazione: mediante apposita striscia di programmazione Alimentazione: 2 batterie al litio da 3 Volt (CR2032) Durata delle batterie: autonomia per determinazioni circa Certificazione CE: il sistema risulta conforme alla direttiva IVDD 98/79/CE Classe tecnologica: 2b Controllo Qualità: soluzioni di glucosio a titolo noto ELITE™ Control Dimensioni: 81 x 51 x 14 mm Peso: 50 grammi circa Contenuto confezione: 1 strumento, 1 custodia, 1 striscia di verifica, 2 batterie, 1 pungidito MICROLET®, 5 lancette sterili monouso MICROLET®, manuale d’uso del sistema Garanzia strumento: 3 anni dalla data di acquisto Produttore: Bayer Consumer Care AG Postfach 4002 Basel Switzerland Distributore: Bayer Spa Viale Certosa, 130 20156 Milano Italy

70 Aumento della sensibilità del metodo
ENZYME CYCLING G6PDH Glucosio-6-fosfato Acido-6-fosfogluconico NADP+ NADPH Acido L-glutamminico Acido ossoglutarico + NH4+ GDH Aumento della sensibilità del metodo

71 Determinazione acidi biliari
Enzymatic assay Bile acids Oxidized bile acids NADH + H+ + NBT NAD+ + formazan 3-a HSD NAD+ NAD + H+

72 Bile acids Determinazione acidi biliari Enzymatic cycling assay
Thio-NAD Thio-NADH Bile acids Oxidized bile acids 3-a HSD NADH NAD

73 Determinazione acidi biliari
Confronto dei metodi Enzymatic assay Enzymatic cycling Reagent format Lyophilized powder Liquid stable Detection l nm nm Sample volume mL mL Interference by lipemic samples yes no Interference by hemolytic samples yes no Instrument contamination yes no