Lezione venerdì 22_XII_=&

Presentazione sul tema: "Lezione venerdì 22_XII_=&"— Transcript della presentazione:

1 Lezione venerdì 22_XII_=&
transgenia

2 Condizioni di funzionamento
Il gene per la ricombinasi Cre deve essere indotto e deve esprimersi al momento giusto e nel posto giusto Ci sono linee di topi transgenici che esprimono Cre nelle cellule epatiche, oppure nel sistema nervoso centrale SNC o altri sistemi Sono state fatte proteine di fusione con il dominio mutato di legame al ligando (ligand binding domain LBD) dell’ormone degli estrogeni, in modo che la ricombinasi sia confinata nel citoplasma finche’ non viene somministrato l’ormone sintetico che riconosce il recettore e fa traslocare la proteina di fusione con la ricombinasi nel nucleo dove induce la delezione del frammento incluso tra i due siti LoxP (vedi esempio della figura precedente)

3 CRE LOX Analisi del sistema CRE-LOX per topi transgenici con “Gene Targeting” sito e tempo specifici. (Methods 24 , 2001, pag 71-80) D.Metzger e P.Chambon - limitazioni del Gene targeting : l’assenza della funzione colpita (targetet) da mutazione durante le fasi di sviluppo puo’ risultare letale precludendo lo studio di funzioni possibili negli stadi iniziali e successivi a quello letale. - molti geni svolgono funzioni multiple in vari tipi di cellule durante l’ontogenesi e fase postnatale (pleiotropici), questo provoca fenotipi complessi e complica l’individuazione di cellule anomale prodotte da fenomeni con piu’ cause. l’effetto di una mutazione puo’ essere compensata durante lo sviluppo manca il fenotipo alterato nell’animale adulto. Per famiglie di geni si devono mutare piu’ geni della stessa famiglia per prevenire la ridondanza funzionale di espressione che preclude l’identificazione di una funzione di un componente della famiglia genica.

4 Geni pleiotropici - Definire una funzione di un gene membro di una famiglia puo’ essere ancora piu’ complicato quando la famiglia e’ coinvolta in un sistema pleiotropico di un pathway di segnali come i recettori per l’acido retinoico o FGF. - Altri effetti confondenti il knock-out di un gene possono essere il rischio di danno sulla fertilita’e disordini sistemici. - In tutti questi casi sara’ problematico determinare la funzione di un gene in una frazione di cellule ad un certo momento della vita del topo. - inoltre nel caso di modelli animali di patologie umane con mutazioni somatiche come il cancro - Quindi la necessita’ di avere un metodo con l’inattivazione condizionale di un gene e’ molto forte Sono state sviluppate strategie per avere gene-targeting condizionale in topo basato su cellule tessuto-specifico o espressione inducibile sito specifica del gene della ricombinasi CRE del fago P1.

5 CRE-LOX ed RNA interference condizionale
Metodi per interferire con l’espressione di un gene: “stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells” P.N.A.S. vol.99 n.3 pp P.J.Paddison et al. - mutagenesi, mutazioni termo sensibili(condizionali), soppressori - knock out per ricombinazione - anticorpi contro la proteina (prodotti da un vettore) - RNA antisenso trascritto da un vettore - oligo antisenso Questi metodi hanno il difetto di non essere sempre applicabili ai sitemi eucarioti; in certi casi non sono regolabili. L’RNA antisenso per funzionare deve essere aggiunto in dosi massicce, oppure deve essere trascritto dentro la cellula, ma il funzionamento della interferenza e’ legata al sistema Dicer, cioe’ ad un pathway enzimatico che riduce l’RNA specifico del messaggero in frammenti. E’ stato fatto un esperimento sfruttando il metodo CRE Lox per produrre un RNA a doppio filamento per bloccare l’enzima Dicer stesso

6 Soppressione stabile dell’espressione genica tramite RNA interference in cellule di mammifero
fosforilazione PKR (kinasi) EIF2 dimerizzazione Blocco non specifico della traduzione 2’- 5’ oligodenilato polimerasi Cofattore per la ribonucleasi non - specifica (Rnasi L) dsRNA esogeno (~ 500 bp) P GFP ZEO r L Gene per la resistenza alla zeocina; Le prime 500 bp codificanti di enhanced gr. fluor. prot. EGFP; Lox P; Promotore di citomegalovirus; pcDNA3 attiva Sistema cellulare di difesa antivirale

7 Modello per interferenze con Cre-Lox
GFP ZEO r L Ricombinasi CRE dsGFP

8 Espressione di CRE Rapporto FF:REN Riduzione di 10 volte dell’espressione di FF in cellule trasfettate con i due plasmidi FF/REN FF = firefly luciferase REN = renilla luciferase ds = double strand ss = single strand as = antisense

9 Lezione 17-18 OrgTransgenici 19-1-06
La selezione tramite incroci ha prodotto organismi innaturali almeno quanto gli organismi transgenici. Per quanto riguarda la trasmissione orizzontale di informazione genetica ci sono prove che sia avvenuta per via naturale ed il pericolo che avvenga con geni esogeni a specie diverse che ne sono privi esiste. Ma si deve sapere se i geni che si usano possono creare rischio. Sicuramente il criterio di cautela è il più sicuro. Le stesse preoccupazioni sono state giustamente poste quando iniziarono i clonaggi con vettori di espressione usando batteri e reistenze ad antibiotici. Sono nati i laboratori a contenimento negativo da cui non possono uscire batteri ricombinanti.

10 Organismi trangenici Dopo l’esperienza con i procarioti è stato possibile fare organismi transgenici con organismi eucariotici. La difficoltà non era sulla complicazione della manipolazione di organismi pluricellulari, ma solamente tecnici. Cioè la manipolazione del DNA è sempre la stessa, il problema è veicolarlo ed integrarlo nei genomi. A differenza dei batteri non ci sono plasmidi nelle cellule degli organismi complessi. L’integrazione in un genoma può creare dei problemi sia al frammento da integrare sia al genoma ospite. C’è stata e c’è una notevole differenza tra i modi di produrre organismi transgenici vegetali o animali. Per alcuni organismi vegetali si possono usare con facilità dei trasposoni che facilitano l’integrazione nel genoma. Per integrarsi un costrutto deve comunque ricombinare. Finchè non erano note molte sequenze la ricombinazione era esclusa anche perché evento raro (≈ 10-6)

11 Oragnismi transgenici II
Per fare ricerca i primi organismi transgenici sono stati la Drosofila ed il Topo e tra i vegetali Arabidopsis e Nicoziana. In generale sono stati usati gli organismi modello già usati in genetica di cui c’erano sufficienti informazioni. Per gli organismi vegetali il problema principale è la veicolazione del DNA attraverso le protezioni esterne come la cellulosa, per cui o sono stati usati virus o batteri trasformanti o micro sfere ti metallli pesanti (oro) come proiettili adsorbiti col DNA. Negli animali le cellule sono più facilmente penetrabili e però l’uso dei virus come veicolo è il metodo più efficiente, però resta il pericolo del virus che deve essere deattivato e non deve ricombinare per ridare origine al virus “wild type” infettivo. Nel topo la tecnica iniziale è stata quella di utilizzare la blastocisti che era già utilizzata dai biologi dello sviluppo. Il primo successo è stato ottenuto generando un topo chimerico.

12 Topi chimerici e transgenici
Per fare un organismo transgenico si deve arrivare a trasformare le cellule della linea germinale oppure il nucleo dello zigote. Nel topo in cui è problematico intervenire sugli uni e sull’altro è stato utilizzata la blastocisti su cui già veniva fatta sperimentazione. La facilità di uso dipende dal fatto che si riconosce più facilmente da uno zigote e si riesce a trovare facilmente nell’utero di una topolina accoppiata durante la notte. Dopo l’accopiamento in poche ore si forma un tappo vaginale che è il segno dell’avvenuta fecondazione. La topolina da accoppiare viene trattata con estrogeni per far avvenire l’ovulazione e per aver un buon numero di blastocisti. I primi topi chimerici sono stati ottenuti iniettando direttamente il DNA nella blastocisti che lo riassorbe e con buona probabilità riesce a trasformare le cellule.

13 Dal chimerico al transgenico
Iniettando il DNA nella blastocisti qualche cellula potrà assorbire il DNA, ma non tutte e quindi si otterrà un topo chimerico in cui non tutti i tessuti hanno nel genoma il DNA iniettato (con un costrutto adatto per essere funzionale ed esprimersi, cioè un gene completo e più spesso artificiale, recante un promotore forte costitutivo come quello di un virus). Questo tipo di vettore se porta un gene per una resistenza ad un antibiotico non deve essere diffuso fuori dal laboratorio. Tra questi topi chimerici ci potrebbe essere quello che ha assorbito e ricombinato nella linea germinale e che quindi può dare origine ad una linea transgenica. Quindi va fatto un incrocio con un topo della linea isogenica per poter riconoscere eventualmente dal pelo se si è trasmesso il gene marcatore. Quindi se si ottiene una F1 transgenica si reincrocerà sempre con topi isogenici a quelli utilizzati per fare il topo chimerico.

14 Controllo del topo transgenico
Come si può essere certi che il topo sia transgenico a parte il colore del pelo (non sempre si associa un marcatore per il colore del pelo) ? Si deve analizzare il DNA dell’animale, nel caso del topo si prende un frammento della coda che non provoca troppo trauma o danno fisico e se ne analizza il DNA tramite Southern blot o tramite PCR. Per sapere dove si è integrato si deve clonare il frammento corrispondente a quello del Southern con PM alterato e sequenziarlo, con PCR si deve fare PCR inversa e trovare la sequenza dei frammenti limitrofi al costrutto integrato. Se il gene che si esprime corrisponde ad un fenotipo atteso, oppure diverso dal wt si ha questa ulteriore verifica. Per sapere se si sono integrate più copie con il Southern si ha risoluzione migliore e cosa si vede? Per PCR inversa cosa si deve fare per vedere se c’è più di una copia ?

15 Schema in cui si mostra l’iniezione con cellule, col DNA è uguale

16 Come si forma la blastocisti

17 Stadi diversi di maturazione dalla morula
alla blastocisti

18 Ricombinazione omologa e cellule ES
Topi transgenici con iniezione diretta del DNA nella blastocisti possono avere il gene esogeno in un punto qualunque del genoma e non sempre si potrà esprimere come vorremmo, dipende dal sito in cui si inserisce. Potrebbe essere un sito silente oppure che provoca danno ad una funzione del topo, per cui non è vitale. Soprattutto si riesce solo a fare esprimere un gene e non si può interferire con una funzione genetica endogena del topo, caso mai si interferisce col metabolismo. Capecchi ed alcuni altri sono riusciti a coltivare cellule ES embrionali staminali di topo e a trasformarle per cui si poteva ottenere un topo chimerico con efficienza iniettando le cellule già con il DNA integrato e sapendo anche dove ecc. La cosa più eclatante è stata la possibilità di ottenere cellule ES trasformate con DNA ricombinato in un sito specifico per ricombinazione omologa. Prime prove con gene HPGRT

19 Vettore per Ricombinazione omologa
I primi esperimenti di ricombinazione omologa furono fatti da Capecchi con il gene per la resistenza HGPRT ipoxantina-guanina fosforibosil Transferasi. Il problema e’ di selezionare le cellule con un fenotipo, ma sono pochi i geni con un fenotipo selettivo, in tale assenza di norma si utilizza la res. per un antibiotico. Il costrutto per far avvenire la ricombinazione omologa deve avere una regione omologa a quella con cui vogliamo ottenere la ricombinazione: w.t. mut. vettore a struttura W x x Di solito si utilizza un costrutto che abbia due regioni di omologia (spalle) rispetto alla regione che si vuole inserire. La frequenza e’ stata studiata ed e’ ~ 1- 2 x10 -6

20 Controlli per l’integrazione di vettori con ricombinazione omologa
Controlli delle cellule staminali ES con cui si devono ottenere successivamente i topi transgenici. La trasformazione delle cellule ES si può fare per elettroporazione o con metodi trasfettanti che permeabilizzano la menbrana, si aliquotano le cellule e si opera la selezione per l’antibiotico. Si espandono le colonie per avere cloni isogenici (tutte le cellule di un clone hanno avuto lo stesso evento di ricombinazione). Si analizzano i diversi cloni per PCR per vedere se la ricombinazione è avvenuta come desiderata, cioè tramite le spalle del vettore nel sito omologo. Il vettore conterrà nella regione non omologa di solito una resist. E magari un marcatore di espressione (lac z che può far colorare di azzurro le cellule ricombinanti con l’indicatore). Si amplifica per PCR partendo dal vettore con una regione esterna

21 PCR di controllo di integrazione
resist. antibiot. genoma org a b a e b sono le sequenze omologhe al gene con cui si vuole fare avvenire la ricombinazione ed il Knock out della funzione, per cui per verificare l’integrazione con PCR un primer dovrà essere nella regione esogena e l’altro nella regione genomica limitrofa alla sequenza che è stata inserita nel vettore che è presente in entrambe e così permette la ricombinazione omologa

22 Topi transgenici mutanti condizionali
Il limite principale dei topi transgenici knock-out per un gene e’la possibile mortalita’ degli omozigoti durante lo sviluppo. - una soluzione per questo problema potrebbe essere l’induzione della mutazione tempo e tessuto specifica - e’ stato applicato il sistema di ricombinazione fagica (fago P1) Cre-Lox utilizzato anche in biologia cellulare perche’ inducibile - Cre e’ la ricombinasi (causa ricombinazione) e LoxP (locus di crossover in P1), serve per mantenere una sola copia del genoma, evita i multimeri - i siti Lox sono costituiti da palindrome di 13 bp ed una regione centrale di 8bp - la ricombinasi fa avvenire lo scambio di filamento tra due strutture Lox allineate originando delezione se sono in tandem, inversione se sono in palindrome, duplicazione se sono su cromatidi fratelli e integrazione se c’e’ un elemento in un plasmide ed un altro nella sequenza dove si integra (vedi fig. 1)

23 Mutanti condizionali Il sistema cre-lox
Sfruttando il sistema di ricombinazione del fago P1 con i siti Lox e la ricombinasi Cre, si possono ottenere dei mutanti che perdono la regione voluta solo attivando la ricombinasi Cre. Si devono costruire dei vettori con siti Lox (di solito in due introni diversi) all’esterno della regione genetica da eliminare. Si chiamano floxed gli esoni o le regioni da excidere. Con questa strategia si possono ottenere topi transgenici per geni che sono letali in fasi diverse e soprattutto con l’espressione della ricombinasi Cre tessuto specifica, si può far avvenire il knock-out del gene solo in particolari tessuti dove si esprime o dove si induce Cre.

24 Il costrutto per il gene floxed
Il gene per la timidino kinasi del virus Herpes simplex rende le cellule sensibili al Ganciclovir Nel caso di ricombinazione non omologa il gene tk non verra’ eliminato e le cellule potranno essere eliminate con la selezione dell’antibiotico Dopo l’eliminazione della resistenza alla neomicina per l’induzione del gene Cre le cellule ES mutanti sono pronte per essere iniettate nelle blasocisti esone x esone y introne x esone z gene tk loxP - neo - loxP loxP costrutto loxP loxP ricombinaz. e delez. neo induz. di Cre omologa ricomb. neo

25 Topi transgenici che esprimono Cre
Controllo dell’espressione di Cre tramite promotore tessuto specifico Enhancer tessuto specifico del gene di topo mDach I (D6) il promotore è attivato al giorno 10.5 (post coitum) Il topo D6Cre incrociato con il topo Gtrosa (B6.129S7) gal si colora in blu perché libera l’espressione eliminando un gene floxed interposto tra il promotore e LacZ.

26 sito per topi con costrutti Cre
Ceppi di topo che esprimono il gene Cre in tessuti diversi

27 costrutto per un gene del SNC
pJOJO CMV-IE  actina loxP-GFP-loxP IRES lacZ poly A cDNA Ngi Ngi Nerve growth inibitor da gene trapping CMV promotore del citomegalovirus IE enhancer  actina di pollo GFP green fluor. protein floxed IRES internal ribosome entry site di encefalomiocardite Lac Z per la  galattosidasi

28 Ligand inducible Cre Recombinase
L’attivita’ di molti enzimi (oncoproteins, fattori di trascriz., RNA-binding prot., kinasi) puo’ essere controllata in maniera dipendente dal Ligando se fusa al dominio che lega il ligando LBD (ligand binding domain) di un recettore di un ormone steroideo. E’ stata fatta una proteina chimerica attiva della ricomb. Cre - LBD del recettore dell’estrogeno (ER) per cui l’attivita’ della ricombinasi Cre-ER dipende dalla presenza di 17b-estradiol. Per non avere il controllo della proteina in presenza di estradiolo endogeno: e’ stato mutato il LBD del recettore ER (Cre-ERT) in maniera da legare solo un ligando sintetico (tamoxifen =Tam, 4idrossi tamoxifen=OHT) sfruttando la mutazione nota (Gly 525 Arg). Questo costrutto funziona in cellule in vitro. -Esperimento di espressione del gene in topo transgenico : costrutto messo sotto il controllo del promotore/enhancer del gene IE di CMV (citomegalovirus) il frammento PvuII del costrutto pCMVCre-ERT iniettato in zigoti F1(C57BL/6XSJL), analisi del transgene da DNA caudale.

29 Prova di espressione e funzionamento su un topo transgenico
“floxed” per il gene del recettore dell’acido retinoico a RXR dopo induzione di Cre (controllo di funzionalità di Cre) RXRa wt RXRa (targetet floxed gene) E8 E9 7 8 LoxP Tk neo 5 6 RXRa (targetet floxed gene After CRE recombinase) Prodotto di PCR bp Primers 7 e 8 Prodotto di PCR 190 bp 100 50 mRNA CRE Er % 80 40 60 30 Excision of floxed marker 40 20 20 10 tail skin liver kidney spleen stomach uterus lung brain muscle hearth thymus Livello di espressione di CRE (pallini) e di excisione dopo 3 giorni e dopo 1 giorno nella coda

30 Lavoro Victr 3 e Victr 20 gene trap
Lettura e commento del paper di Nature 1998 vol 392 / 9Aprile pp : Disruption and sequence identification of 2,000 genes in mouse embrionic stem cells (ES). Brian P. Zambrowicz et al. Gene trapping : metodo di mutagenesi per inserzione random con vettori per geni reporter o selezionabili. -l’inserzione genera la marcatura (tags) di geni successivam. clonabili -espressione solo se l’inserzione avviene in introni, esoni o promotori di geni attivi restringendo il tipo di geni marcabili -finqui’ non esiste automazione per l’identificazione dei geni bersaglio che possono non essere trascritti o corrispondono alla regione 5’non tradotta, Per superare questi limiti sono stati sviluppati due nuovi vettori per GeneTrapping: VICTR3 e VICTR20

31 Gene trapping tramite Victr 3 e 20
vettori per il 3’o 5’ “trapping”(presenza di LTR virali per l’integrazione nel genoma ospite) Wild-type locus PGK LTR SD puro SA pA IRES geo G AAAAAn VICTR3 PGK LTR SD puro VICTR20 SA pA IRES geo

32 Costrutti VICTR3 VICTR20 2 componenti : - a) acquisizione di sequenza con promotore della PGK (fofsfo glicerokinase) di topo attiva nelle cellule ES fuso alla Puromicina N-acetiltransferase senza polyA ma con un sito SD (splice donor) - b) SA (splice acceptor) fuso ad un marker selettivo e reporter (colorimetrico) con sito polyA (SAbgeobpA o SAIRESbgeobpA) Questi costrutti non hanno bisogno di inserirsi in geni attivi per essere marcati (trapped) e la sequenza si individua tramite RACE 3’ del cDNA di fusione e ricerca in banca dati del gene. -Prova di efficienza del vettore PGKpuroSD ricercando il gene della Hgprt = Hprt (ipoxantina-guanina fosforibosiltransferase per ricombinazione omologa nell’ introne II. (I geni Hprt e tk timidino-kinasi mutati danno la sensibilita’ al terreno HAT hypoxanthine, aminopterin and thymidine e solo Hprt resistenza alla 6-thioguanina). La sequenza della 3’RACE di colonie Purom. res. hanno confermato l’integrazione nel sito corretto confermando la capacita’ mutagenica del costrutto.

33 gene trapping di VICTR-3/VICTR-20
Race per gene trapping gene trapping di VICTR-3/VICTR-20 VICTR-3 è costruito per funzionare con l’integrazione all’interno geni attivi e non attivi. Per individuare il gene di fusione che si ottiene si deve fare RACE 3’ ed eventualmente gene walking al 5’ dopo aver individuato la regione.

34 costrutti per gene trapping
PT1  geo lacz neo pA  geo ee ei ei engrailed 2 intron; ee eng 2 exon geo = lac z - neo fusion pA poly adenilation signal  geo U RU5 U RU5 Sup 5 U3  geo U3 LTR region enhancerless Mol mur Leuk Sup 5 E. coli sup F tRNA RU5 Mason-Pfizer monkey virus translational enhancer sa Lac Z P-neo TS4