Promotori eucariotici

Presentazione sul tema: "Promotori eucariotici"— Transcript della presentazione:

1 Promotori eucariotici
RNA pol I trascrive rRNA RNA pol II trascrive mRNA per proteine RNA pol III trascrive tRNA e 5S rRNA

2 RICONOSCONO I PROMOTORI?
LE RNA POLIMERASI COME RICONOSCONO I PROMOTORI? Transcribed region Promotore -contiene sequenze Specifiche per il legame della polimerasi

3 DEL PROMOTORE PROSSIMALE
FATTORI DI TRASCRIZIONE • FATTORI DI TRASCRIZIONE GENERALI (BASALI) - RICONOSCONO ELEMENTI “core promoter” • REGOLATORI SPECIFICI - ATTIVATORI - REPRESSORI Basal factor binding sites Transcribed region ELEMENTO ENHANCER ELEMENTO DEL PROMOTORE PROSSIMALE

4 Il legame promotore RNA polimerasi
richiede i fattori di trascrizione generali

5 Promotori ~200 bp gene

6 ATTIVITA’ 100% 100% 20% 1% 0% COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE
Reporter gene eg CAT, luciferase 100% Reporter gene 20% Reporter gene 1% Reporter gene 0% Reporter gene

7 COME IDENTIFICARE ELEMENTI NEL PROMOTORE
ATTIVITA’ 100% Reporter gene eg CAT, luciferase 100% Reporter gene 400% Reporter gene 1% Reporter gene 0% Reporter gene

8 attivato basale Livello di trascrizione represso

9 Elementi del Core promoter
• siti di legame per I fattori di trascrizione generali Che supportano un livello di trascrizione basale La regolazione della trascrizione e’ ottenuta dalla Azione di fattori di trascrizione gene-specifici Transcribed region

10 6 bp elemento ricco in purine
RNAP II Inr DPE BRE TATA ~24bp TATA-box 8 bp elemento ricco in AT Bound by TFIID BRE 6 bp elemento ricco in purine Bound by TFIIB Inr DPE Bound by TFIID

11 TFIIF 2 subunits 2 subunits RNAP II TFIIA 2-3 subunits 12 subunits
TFIIE TFIIF 2 subunits 2 subunits RNAP II TFIIA TFIID 2-3 subunits 12 subunits 10 subunits TFIIB TFIIH 1 subunit ~40 polipeptidi 9 subunits

12 RNAP II Inr DPE TATA-box 8 bp AT lega TFIID BRE 6 bp lega TFIIB Inr

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16 TFIID TFIIF RNAP II ~24bp TATA BRE Inr DPE TFIIA TFIIB TFIIE TFIIH

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18 TFIID contiene la TATA-Box Binding Protein TBP TFIID

19 TFIID e’ composta da vari TBP Associated Factors
—TAFs -aiutano il posizionamento di TFIID riconoscendo L’elemento Inr -legano i fattori di trascrizione gene specifici -aiutano a decompattare la cromatina

20 TFIID ~24bp TATA BRE Inr DPE

21 TFIIA TFIID TFIIA -aumenta e stabilizza il legame di TBP al DNA
TATA BRE Inr DPE TFIIA -aumenta e stabilizza il legame di TBP al DNA -interagisce con vari attivatori gene specifici Aiutandoli a legarsi ai vari TAF

22 TFIIB TFIID TFIIA TFIIB -si lega a TBP e richiama la polimerasi
TATA BRE Inr DPE TFIIA TFIIB -si lega a TBP e richiama la polimerasi -Partecipa alla selezione del sito d’inizio e Stabilisce la direzione

23 TFIIF TFIIF TFIID TFIIA TFIIB RNAP II
~24bp TATA BRE Inr DPE TFIIA TFIIB Stabilizza il complesso di preinizio e induce Una torsione nel DNA

24 TFIIE TFIIF TFIID TFIIA TFIIB RNAP II
~24bp TATA BRE Inr DPE TFIIA TFIIB TFIIE Attira una elicasi ed insieme srotolano il Promotore. Stimola l’attivita’ chinasica di TFIIH

25 TFIIH TFIIF TFIID TFIIA TFIIB RNAP II TFIIH
~24bp TATA BRE Inr DPE TFIIA TFIIB TFIIE TFIIH Fosforila una delle subunita’ della polimerasi dando l’avvio alla trascrizione

26 — REGOLATORI GENE SPECIFICI
Transcribed region SI LEGANO A SEQUENZE REGOLATORIE

27 Regolatori gene specifici
• hanno una struttura modulare • contengono un dominio che lega il DNA • contengono uno o piu’ domini di attivazione trascrizionale • qualche volta contengono uno o piu’ domini di repressione • qualche volta contengono un dominio di dimerizzazione

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32 (MADS box)

33 H O C N H Donatore Accettore

34 A D A M A A D M A D A D A A A A A D A A A A D A

35 Regolatori gene specifici
Contengono un dominio che lega il DNA E un dominio di attivazione trascrizionale Transcribed region

36 Gli Attivatori come influenzano la trascrizione di un gene distante molte migliaia di nucleotidi?
DNA loop

37 Enhancers- stimolano la trascrizione
Attivatori si legano ad un sito specifico Il DNA si ripiega

38 Enhancers- stimolano la trascrizione
Attivatori si legano ad un sito specifico Il DNA si ripiega Si forma il complesso nel promotore

39 Enhancers- stimolano la trascrizione
Attivatori si legano ad un sito specifico Il DNA si ripiega Si forma il complesso nel promotore Si lega la RNA polimerasi Inizio della trascrizione

40 Controllo combinatoriale dell’espressione genica

41 Con poche proteine regolatorie si possono controllare un elevato numero di geni
Diverse combinazioni producono fenotipi differenti

42 Heterodimerization of DNA binding proteins can alter
their sequence specificity

43 Enhancer e Repressori RNAP promotore enhancer gene 10-50,000 bp
repressore enhancer interagiscono con RNAP trascrizione repressore previene il legame dell’enhancer

44 Recettori nucleari Fattori di trascrizione regolati da molecole idrofobiche Cambio dell’attivita’ Cambio della localizzazione cellulare

45 Recettori nucleari Il legame del ligando causa cambiamenti conformazionali TBP TAF RNA pol II RGRACANNNTGTYCY

46 Nuclear Receptors Legame dell’ormone Dissociazione da hsp90 GR GR GR
TATA GR hsp90 GR GR Dissociazione da hsp90 GR hsp90 dimerizzazione Migrazione nel nucleo Legame al DNA

47 Regolazione mediante fosforilazione
Ormoni attivano una chinasi La chinasi fosforila un fattore di trascrizione Il fattore e’ attivato

48 Cascata delle chinasi GF si lega al recettore - protein tyrosine kinase Il recettore dimerizza Il complesso fosforila MEKK – (MAP kinase kinase kinase) MEKK P MEKK SEK SEK P MEKK fosforila SEK – una MAP kinase kinase JNK P JNK P SEK fosforila JNK – una MAP kinase

49 Cascata delle chinasi nucleo TRE
JNK attivata migra nel nucleo e fosforila il fattore di trascrizione C-JUN C-JUN dimerizza with C-FOS per formare AP-1 AP-1 attiva la trascrizione legandosi a –TGA(C/G)TCA- e interagendo con I fattori di trascrizione generali nucleo RNA pol II JNK P C-JUN P C-FOS P C-JUN TRE

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51 Metilazione del DNA La citosina puo’ essere metilata:
Risulta in una maggiore condensazione della cromatina La metilazione del DNA e’ coinvolta nell’inattivazione del cromosoma X

52 Trascrizione e struttura della cromatina
Il DNA nella cromatina condensata non e’ accessibile La cromatina condensata (eterocromatina) e’ trascrizionalmente silente La condensazione della cromatina dipende ANCHE dalla acetilazione degli istoni

53 Acetilazione degli Istoni
E’ una modificazione post-traduzionale Gruppi acetilici (CH3COO–) legati covalentemente a aminoacidi basici Neutralizzano le cariche positive Eliminano le interazioni ioniche con il DNA Diminuiscono la condensazione Associati con una attiva trascrizione

54 Acetilazione/Deacetilazione

55 Attivatori: acetilazione degli Istoni
Alcuni attivatori attirano delle acetilasi Il macchinario di trascrizione puo’ accedere al DNA meno condensato

56 Alcune Istone Acetilasi (HAT)
p300/CBP TAF II 250 Ambedue sono dei co-attivatori SAGA e’ a ponte tra un Fattore di Trascrizione e la TBP

57 Repressori: deacetilazione degli Istoni
Alcuni repressori attirano delle deacetilasi Prevengono l’accesso del macchinario di trascrizione al DNA

58 Acetilazione/Deacetilazione

59 SWI/SNF in Lievito SWI/SNF sono regolatori positivi del gene HO (accoppiamento) e del gene SUC2 (utilizzo del saccarosio). Queste proteine catalizzano il rimodellamento ATP-dipendente del DNA

60 Macchinari di Rimodellamento
Tutti contengono subunita’ simili a swi-2/snf NTP-binding proteins

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63 Regolazione dell’Espressione Genica
Puo’ essere regolata in una delle seguenti sei fasi: NUCLEUS CYTOSOL inactive mRNA degradazione DNA RNA transcript mRNA mRNA trascrizione Maturazione trasporto traduzione protein controllo dell’attivita’ inactive protein

64 Lo Splicing puo’ produrre anticorpi solubili o legati alla membrana dallo stesso gene
Lo splicing alternativo puo’ produrre due tipi di anticorpo diversi con la stessa specificita’ Quando attivati dall’antigene i linfociti B cominciano a produrre anticorpi solubili Le forme secrete mancano degli esoni 7 e 8 che codificano per domini idrofobici Scan Hartwell Fig 8.18

65 L’RNA Editing altera le sequenze dei pre-mRNA
Figure 11-39

66 La deaminasi e’ presente
mRNA editing Nel fegato Deamination of a C to a U creates a stop codon resulting in a truncated form of Apo B in the small intestine rather than the long form found in liver La deaminasi e’ presente solo nell’intestino Nell’intestino

67 Metodi per studiare l’espressione dei geni
Northern blot Trascrittasi Inversa -PCR (RT-PCR) Ibridazione In situ Trascrizione In vitro DNA Microarray

68 Purificazione dell’RNA
Procedura Lisi delle cellule con un reagente che dissocia le nucleoproteine e inibisce la RNAsi Rimozione delle proteine Precipitazione specifica dell’RNA

69 Northern blot Per determinare la dimensione e la quantita’ di specifici mRNA Studi sull’espressione genica

70 Northern blot Elettroforesi dell’RNA in gel contenente formaldeide per mantenere l’RNA in forma completamente lineare Trasferimento dell’RNA su una membrana Ibridazione con una sonda marcata

71 + - tampone elettroforetico
100V 0,2A + - generatore di corrente gel di agarosio scatola elettroforetica tampone elettroforetico es. TAE (4mM Tris-acetato, 1mM EDTA, pH 8.0)

72 Separa le molecole in base alla dimensione
Gel Elettroforesi- Separa le molecole in base alla dimensione

73 Trasferimento su supporto solido

74 Trasferimento dal gel alla membrana

75 Dopo il trasferimento gel membrana

76 Preparare la sonda per il Northern Blot

77 Ibridazione La sonda marcata e’ aggiunta ad una soluzione contenente il supporto solido che lega l’RNA da analizzare

78 Lavaggio Rimozione della sonda non legata al supporto solido

79 Rivelazione degli ibridi
Esposizione di un film se la sonda e’ marcata radioattivamente Se la sonda e’ marcata con un enzima si procede alla reazione enzimatica che produce colore direttamente sul supporto solido

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81 Northern blot La rivelazione avviene usando:
DNA marcato con radioattivo(32P) DNA marcato con un enzima che catalizza una reazione che produce luce o colore

82 Northern blot Fig. 5. Northern blot analysis of E. lagascae total RNA from leaves (L), germinating seeds (Se), roots (Ro) and stems (St). The blot was hybridized with probes for ElLTP1 (top panel) and ElLTP2 (middle panel). The bottom panel shows ethidium bromide staining of the gel before blotting. The numbers to the left indicate approximate transcript sizes in kb

83 Svantaggi del Northern Blot
Richiede grandi quantita’ di RNA E’ un processo lungo e laborioso

84 Ibridazione dell’RNA in situ
Rivelazione di mRNA direttamente su tessuti messi su vetrini da microscopio Preparation of RNA probe with in vitro transcription T7/T3 or SP6 promoter

85 RNA in situ hybridization
Colour substrate: nitro blue tetrazolium (NBT) + 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) Fig. 7. RNA in situ hybridization with antisense (a-c) and sense (d) RNA probes for ElLTP1. E. lagascae seedlings were collected 7 days after sowing. co Cotyledon, en endosperm, hy hypocotyl, am apical meristem, ro root

86 Il livello di RNA presente nella cellula non necessariamente riflette direttamente i livelli di trascrizione del gene Per poter asserire che un gene viene attivato TRASCRIZIONALMENTE occorre poterne visualizzare l’attivita’

87 Il saggio di “run-on” (o della catena nascente di RNA) permette di determinare il livello di trascrizione di un gene Purificare i nuclei + NTP, 32P GTP Trascrizione: la catena nascente e’ radioattiva Estrazione dell’RNA Ibridazione a cDNA immobilizzato su filtro

88 Sintesi differenziale di 12 geni codificanti mRNA epato-specifici analizzata tramite run-on
Lodish Figure 10-23

89 Northern blotting RNA isolation Probe labeling Gel electophoresis
AAAAAA Probe labeling pBS-SemaIII dATP dGTP dTTP dCTP Gel electophoresis Hybridization Blotting Autoradiography Northern blotting allows easy and more or less quantitative detection of a limited number of transcripts. Total RNA (or mRNA) is separated on an agarose gel and transferred to a nylon membrane. This membrane is then incubated with a radiolabeled probe derived from the gene of interest. After hybridization, size and amount of the corresponding transcript in the RNA pool are revealed by autoradiography. The method is not very sensitive.

90 reverse Northern blotting
Reverse Northern blotting is the opposite of Northern blotting. Here, specific probes are immobilized on a nylon membrane and subsequently hybridized to radiolabeled cDNA derived a pool of mRNA. Multiple identical membranes can be hybridized with different cDNA pools, and the relative intensity of the hybridization signal for each spot will reveal the extent of regulation of the corresponding transcripts. This method depends has evolved into the modern cDNA macro and micro array techniques.