La regolazione dell’espressione genica

Presentazione sul tema: "La regolazione dell’espressione genica"— Transcript della presentazione:

1 La regolazione dell’espressione genica
Tutte le cellule di un organismo multicellulare possiedono tutti i geni della propria specie; tuttavia solo una piccolissima frazione è attiva in ogni cellula; per esempio, in una cellula delle isole del pancreas è attivo il gene per l’insulina, non quelli per l’emoglobina (attivi nelle cellule dei midollo osseo, progenitrici dei globuli rossi) o per la pepsina (attivi nelle cellule della mucosa gastrica) Durante lo sviluppo embrionale di un organismo multicellulare, le cellule destinate a costituire i diversi tessuti e organi attivano in momenti precisi i geni che codificano le proteine che stimolano o inibiscono la proliferazione cellulare e quelle caratteristiche del tessuto in formazione (per esempio osseina per le ossa, cheratina per la pelle) Anche gli organismi unicellulari hanno bisogno di attivare alcuni geni solo in particolari circostanze (per esempio la presenza di un nutrimento che richiede particolari enzimi) per non sprecare l’energia e le molecole necessarie Le cellule tumorali hanno perduto, anche in seguito a mutazioni somatiche, la capacità di regolare l’espressione genica relativa alle proteine che controllano la proliferazione cellulare Finora si è spiegato cosa sono i geni, come vengono ereditati, come sono organizzati nei cromosomi, come mutano, qual è la loro natura molecolare (DNA), quali sono i loro prodotti (RNA e proteine) ma non come funzionano: l’espressione genica, cioè la trascrizione di specifici RNA, non è un’attività costante e comune a tutti i geni di una cellula; in ogni cellula sono attivi in ogni momento i geni “utili” in quel momento, grazie a “segnali” che provengono dall’ambiente e che la cellula riceve attraverso i suoi “recettori” e, mediante un passaggio interno dei segnali, trasmette ai propri geni. Tutte le cellule hanno tutti i geni caratteristici della specie; quindi fenomeni come il differenziamento cellulare durante l’embriogenesi (una cellula embrionale può diventare un neurone, una cellula del sangue, una cellula ossea), la produzione di particolari proteine in tessuti specifici dopo il differenziamento (l’insulina nel pancreas, la pepsina nello stomaco), la perdita di regolazione della proliferazione cellulare nelle cellule tumorali, l’adattamento degli organismi unicellulari alle condizioni ambientali (la formazione di spore resistenti in condizioni sfavorevoli) possono essere interpretati nei termini della regolazione dell’espressione genica; intere branche della genetica moderna (la genetica dello sviluppo, la genetica della cancerogenesi) si occupano di questi processi. Nella prima parte delle diapositive di questa serie (1-5) verrà descritto un semplice sistema di regolazione dell’espressione genica relativo al sistema lac di Escheirichia coli, studiato da Jacob e Monod negli anni ’60 del secolo scorso, costituito da un gruppo di geni che consente di utilizzare il lattosio come fonte di carbonio e di energia al posto del glucosio. Dunque nelle prossimità dei geni ci devono essere recettori in grado di percepire segnali provenienti dall’ambiente esterno e veicolati all’interno della cellula; tali recettori devono quindi segnalare ai geni se trascrivere o no, in funzione dei segnali provenienti dall’esterno L’esempio che viene proposto nelle diapositive 2-5 riguarda la regolazione dell’attività dei geni (detta “espressione genica”) relativa agli enzimi per il metabolismo del galattosio in Escheirichia coli (sistema lac)

2 Il sistema lac in E. coli Lattosio
H O C1’ C5’ C2’ C3’ HOC6’H2 C4’ OH Lattosio + H2O L’enzima b-galattosidasi, che consente di utilizzare il lattosio come fonte di carbonio e di energia, viene sintetizzato in presenza di lattosio che quindi oltre che esserne il substrato è anche l’induttore della sua sintesi b-galattosidasi O C1’ C5’ C2’ C3’ HOC6’H2 C4’ OH H OH O C1’ C5’ C2’ C3’ HOC6’H2 C4’ H Il lattosio è un disaccaride, cioè un polimero costituito da due molecole di zuccheri; le 2 molecole appartengono a 2 zuccheri diversi: il glucosio e il galattosio; l’enzima capace di sciogliere il legame fra le 2 molecole e di rendere quindi il glucosio disponibile per il metabolismo cellulare, è la beta-galattosidasi. Ciò che rende interessante questo enzima per lo studio sulla regolazione dell’espressione genica è il fatto che quando nell’ambiente non è presente il lattosio, il gene che codifica per questo enzima non è attivo, quindi l’enzima non è presente nella cellula batterica; quando invece si somministra lattosio nel terreno di coltura, il gene viene attivato e l’enzima viene prodotto; quando la scorta di lattosio finisce, il gene viene inattivato e l’enzima non viene più prodotto; quindi il lattosio non è solo il substrato dell’enzima, è anche l’induttore dell’espressione del suo gene. I geni che codificano per altri 2 enzimi, la permeasi, che facilita l’ingresso del lattosio, e la trans-acetilasi, vengono attivati in presenza di lattosio e inattivati in sua assenza. Dal lattosio è indotta la sintesi di altri 2 enzimi: permeasi e transacetilasi; anche la permeasi è coinvolta nel metabolismo del lattosio, poiché facilita l’ingresso del lattosio nella cellula. Glucosio Galattosio

3 I geni strutturali e il gene I
I+ = allele normale:Z, Y, A trascrivono in presenza dell’induttore; I- = mutante costitutivo: Z, Y, A trascrivono sempre; Is = allele inibente la risposta all’induttore: Z, Y, A non trascrivono mai I Z Y A trascrizione Merodiploidi per definire le relazioni funzionali tra gli alleli Un unico mRNA policistronico I+Z-/I-Z+ Trascrive* con l’induttore I-Z-/I+Z+ I-Z-/I-Z+ Trascrive* sempre IsZ+/I+Z+ Non trascrive mai IsZ+/I-Z+ traduzione b-galattosidasi transacetilasi F’(lac) I geni Z (che codifica per la beta-galattosidasi), Y (per la permeasi) e A (per la trans-acetilasi) vengono trascritti insieme e il prodotto della trascrizione è un unico mRNA policistronico, che cioè è la trascrizione di più cistroni (si ricordi che il cistrone coincide con il gene, definito in base alla sua funzione; vedere serie 2, diapositiva 24), cioè di più geni; successivamente, durante la traduzione, vengono prodotte 3 diverse catene polipeptidiche che costituiscono i 3 enzimi. I 3 geni che codificano direttamente per gli enzimi vengono chiamati “geni strutturali”, per distinguerli dai “geni regolativi” che hanno solo una funzione di attivazione-inattivazione dei geni strutturali. Per questi 3 geni è stato possibile ottenere alleli non funzionali, cioè alleli i cui prodotti non presentano attività enzimatica (Z-, Y-, A-). Nei ceppi normali di E. coli i geni Z, Y, A sono trascritti in presenza di lattosio e non trascritti in sua assenza; tuttavia ci sono ceppi mutanti in cui la trascrizione di Z, Y, A avviene anche in assenza di lattosio (“mutanti costitutivi”), mentre vi sono altri ceppi mutanti in cui la trascrizione di Z, Y, A non avviene nemmeno in presenza di lattosio (inibizione della risposta all’induttore). Si è chiamato I il gene responsabile dell’induzione della trascrizione dei geni Z, Y, A; mediante mappatura si è verificato che tale gene non è vicino ai geni Z, Y, A. Per definire le relazioni funzionali fra i 3 alleli scoperti (I+, l’allele normale; I-, l’allele “costitutivo”; Is, l’allele inibitore) si è fatto ricorso a ceppi batterici merodiploidi stabili, appositamente costruiti, in cui tutti i geni del sistema lac (incluso I) fossero in condizione diploide, cioè presenti in 2 copie nella stessa cellula. Per questo si è trasmesso, mediante coniugazione batterica, un fattore F’ (lac), cioè un fattore F in cui sono inseriti tutti i geni del sistema lac (serie 2, diapositiva 19), con alleli adatti allo studio, in batteri F- che hanno i geni del sistema lac sul loro cromosoma, anch’essi con alleli adatti. Con adeguate combinazioni di alleli (funzionali o non funzionali per Z, Y, A; I+, I-, Is) in diversi ceppi merodiploidi, come si vede nella tabella in basso a destra nella diapositiva, si è visto che Is è dominante su I+ e su I- e che I+ è dominante su I-. Questa relazione di dominanza è indipendente dalla posizione sullo stesso cromosoma o sui 2 cromosomi diversi degli alleli di I rispetto agli alleli funzionali di Z, Y, A; ovvero la dominanza si esprime sia in cis (l’allele di I studiato è sullo stesso cromosoma degli alleli funzionali di Z, Y, A) che in trans (l’allele di I studiato è sull’altro cromosoma rispetto agli alleli funzionali di Z, Y, A). Questo risultato si spiega se si ammette che il gene I codifichi per un prodotto diffusibile che può avere effetto su entrambi i cromosomi. permeasi Geni lac 1) Is è dominante su I+ che a sua volta è dominante su I- *un mRNA per un enzima funzionale 2) I+ è dominante su I- indipendentemente dalla posizione in cis o in trans rispetto a Z+

4 Operatore, promotore e operone
I P O Z Y A operone O+ = allele normale:Z, Y, A trascrivono in presenza dell’induttore; Oc = mutante costitutivo: Z, Y, A trascrivono sempre O+Z+/OcZ+ Trascrive* sempre O+Z+/OcZ- Trascrive* con l’induttore O+Z-/OcZ+ IsO+Z+/I+OcZ+ Il prodotto del gene I è una proteina diffusibile che, in assenza dell’induttore, si lega ad O e impedisce la trascrizione di Z, Y , A; in presenza dell’induttore non si lega ad O e consente la trascrizione di Z, Y, A Con lo stesso sistema dei batteri merodiploidi con F’ (lac) si sono studiate le relazioni di dominanza degli alleli mutati di altri 2 geni: il gene O (operatore) e il gene P (promotore; ma in generale il promotore è considerato una porzione dello stesso gene: serie 4, diapositiva 14). Prima di tutto i geni P ed O sono adiacenti fra loro e O è adiacente a Z. Gli alleli di O sono l’allele normale O+, che blocca la trascrizione di Z, Y, A in assenza di lattosio e la consente in sua presenza; Oc, allele “costitutivo”, che consente la trascrizione di quei geni anche in assenza di lattosio. Questi risultati hanno consentito di verificare che il prodotto dell’allele I+ del gene I è una proteina diffusibile, detta repressore, che, in assenza dell’induttore (il lattosio) si lega ad O e impedisce la trascrizione di Z, Y, A e in sua presenza non si lega ad O e consente la trascrizione di Z, Y, A; quando, invece dell’allele normale O+, è presente l’allele Oc, il repressore non si lega mai ad O, nemmeno in assenza dell’induttore, e la trascrizione di Z, Y, A avviene sempre, incondizionatamente. I risultati che hanno consentito questa interpretazione ed hanno consentito di identificare le relazioni di dominanza sono esposti nella tabella al centro, a sinistra nella diapositiva. In un merozigote, Oc è dominante rispetto a O+, ma solo quando è in cis (sullo stesso cromosoma) rispetto agli alleli funzionali di Z, Y, A; quando Oc è in trans rispetto a questi ultimi, non esprime la propria dominanza rispetto a O+. Oc, quando è in cis rispetto agli alleli funzionali di Z, Y, A, sopprime l’effetto degli alleli I+ e Is di I; cioè consente la trascrizione incondizionata dei geni Z, Y, A anche in presenza di questi alleli di I, che altrimenti ne impedirebbero la trascrizione sempre (Is) o in assenza di lattosio (I+). L’allele funzionale del promotore P+, in presenza degli alleli normali I+ e O+, blocca la trascrizione di Z, Y, A in assenza di lattosio e la consente in sua presenza, mentre l’allele non funzionale del promotore P- non consente mai la trascrizione, in assenza come in presenza dell’induttore, quali che siano gli alleli di I ed O. In un merozigote, P- è dominante rispetto a P+, ma solo quando è in cis (sullo stesso cromosoma) rispetto agli alleli funzionali di Z, Y, A; quando P- è in trans rispetto a questi ultimi, non esprime la propria dominanza rispetto a P+. P-, quando è in cis rispetto agli alleli funzionali di Z, Y, A, sopprime l’effetto degli alleli I+ e I- di I e O+ e Oc di O; cioè non consente mai la trascrizione dei geni Z, Y, A anche in presenza di questi alleli di I ed O, che altrimenti ne consentirebbero la trascrizione sempre (I-e Oc) o in presenza di lattosio (I+ e O+); questo effetto è comprensibile se si ricorda che il promotore è la regione a monte del gene da trascrivere cui si lega l’RNA polimerasi (serie 4, diapositiva 14); una mutazione del promotore che impedisse il “riconoscimento” del promotore e il legame ad esso da parte dell’RNA polimerasi impedirebbe in ogni condizione la trascrizione di quel gene. L’insieme dei geni adiacenti P (promotore), O (operatore), Z, Y, A (geni strutturali), che insieme rispondono, consentendo o non consentendo la trascrizione in funzione della presenza o dell’assenza dell’induttore (in questo caso il lattosio), costituiscono un’unica unità funzionale regolata, chiamata operone dai suoi scopritori; altri operpni sono stati successivamente scoperti nei procarioti. *un mRNA per un enzima funzionale 1) Oc è dominante su O+, ma solo in cis rispetto a Z+ (cis-dominanza) 2) Gli alleli normali di P sono cis-dominanti sui mutanti difettivi di P, che impediscono incondizionatamente la trascrizione di Z, Y, A, impedendo l’inserimento della RNA polimerasi

5 Regolazione dell’espressione genica nell’operone lac
repressore non legato all’induttore, che si lega ad O e impedisce la trascrizione RNA polimerasi I P O Z Y A induttore repressore legato all’induttore, che non si lega ad O e non impedisce la trascrizione mRNA I- I P O Z Y A repressore I- senza affinità per O, con cui non si lega mai e non impedisce mai la trascrizione repressore Is senza affinità per l’induttore, che si lega sempre ad O e impedisce sempre la trascrizione I P O Z Y A Is Questa diapositiva riassume i meccanismi attraverso cui si esprimono i fenotipi dei diversi alleli del sistema lac. Nella prima riga è descritto quanto avviene quando sono presenti gli alleli normali per tutti i geni coinvolti: l’RNA polimerasi si lega al promotore; il repressore normale, codificato dal gene I ha una parte della propria molecola che “riconosce” e si lega all’operatore; in questo modo blocca fisicamente il percorso dell’RNA polimerasi e impedisce la trascrizione di Z, Y, A; il repressore tuttavia ha un’altra parte della propria molecola che“riconosce” e si lega all’induttore, se questo è presente nella cellula. Se l’induttore è presente e si lega al repressore, quest’ultimo subisce un cambiamento di forma (“allosteria”) che altera la parte della sua molecola responsabile del legame all’operatore e ne annulla la funzione, impedendo il riconoscimento e il legame all’operatore; in questo caso il repressore legato all’induttore non si lega all’operatore, l’RNA polimerasi trova la strada sgombra e la trascrizione di Z, Y, A procede. L’allele I- produce una molecola di repressore che ha alterata la parte della sua molecola responsabile del legame all’operatore; quindi, anche in assenza dell’induttore, il repressore non si lega mai all’operatore e la trascrizione di Z, Y, A procede. L’allele Is produce una molecola di repressore che ha alterata la parte della sua molecola responsabile del legame all’induttore; quindi, anche in presenza dell’induttore, il repressore si lega sempre all’operatore e la trascrizione di Z, Y, A non procede. L’allele Oc ha perduto la sua affinità per il repressore; quindi, anche in assenza dell’induttore, il repressore non si lega mai all’operatore e la trascrizione di Z, Y, A procede. L’allele P- ha perduto la sua affinità per l’RNA polimerasi; quindi, anche in presenza dell’induttore, l’RNA polimerasi non si lega mai al promotore e la trascrizione di Z, Y, A non procede. operatore senza affinità per il repressore che non lega mai e non impedisce mai la trascrizione I P O Z Y A Oc I P O Z Y A promotore senza affinità per l’RNA polimerasi che impedisce sempre la trascrizione P-

6 Ingegneria genetica Batterio
Le tecniche dell’ingegneria genetica permettono di isolare un gene che codifica per una determinata proteina e di inserirlo, mediante dei vettori adatti, nel genoma di un altro organismo. Queste tecniche sono state applicate al campo della medicina per la produzione farmaci, per la diagnosi di malattie genetiche, per la progettazione di vaccini. In agricoltura si stanno progettando piante e animali transgenici, per aumentarne la produttività e migliorarne la qualità Ma tutto ciò pone problemi nuovi di carattere etico, economico, biologico che devono essere attentamente valutati per la tutela della vita e dell’ambiente. Batterio Cellula contenente il gene da isolare Plasmide isolato DNA purificato Cromosoma batterico Plasmide Gene da isolare DNA ricombinante (plasmide) Inserimento del plasmide nella cellula batterica Le diapositive riguardano le tecnologie del DNA ricombinante che sono alla base delle applicazioni della genetica molecolare alla medicina, all’industria, all’amministrazione della giustizia e all’agricoltura, sia dal punto di vista diagnostico e di riconoscimento e identificazione delle sequenze (identificazione personale mediante il DNA, paternità contestata, riconoscimento dell’origine dei mangimi destinati al bestiame, diagnosi di malattie ereditarie, di suscettibilità a particolari fattori ambientali), sia dell’aumento delle conoscenza (identificazione delle sequenze di interi genomi di specie importanti dal punto di vista teorico e/o applicativo, come Drosophila, Escheirichia coli, il topo e lo stesso uomo, con il ben noto progetto sul Genoma Umano da poco concluso), sia della modificazione dei genomi di particolari cellule o organismi (microrganismi di interesse farmaceutico o industriale, animali di laboratorio per ricerche biomediche, cellule staminali - cioè non differenziate e in grado di proliferare - per la terapia genica – cioè per inserire cellule con geni funzionanti in un tessuto le cui cellule presentano lo stesso gene non funzionante, con conseguenze di tipo patologico - , piante coltivabili e animali da allevamento transgenici, cui cioè sono stati inseriti particolari geni). L’uso di queste nuove tecnologie presenta numerosi vantaggi (si pensi ai vantaggi della terapia genica o all’abbattimento dei costi nella produzione e nella maggiore efficacia di polipeptidi di interesse farmacologico da parte di batteri modificati geneticamente) ma pone anche numerosi problemi: etici (l’inserimento a scopo terapeutico di cellule staminali geneticamente modificate nei tessuti somatici umani costituisce un aumento della capacità di intervento terapeutico e non pone problemi etici, mentre la modificazione genetica di cellule della linea germinale nell’uomo e quindi della progenie pone gravi problemi etici), scientifici (la modificazione genetica mediante incroci, selezione e, nell’ultimo secolo, mediante mutagenesi, ha modificato il patrimonio genetico delle specie animali, vegetali, fungine, batteriche di interesse economico; ma le nuove tecnologie consentono, al contrario delle precedenti, di inserire geni di un organismo in un organismo molto lontano da un punto di vista evolutivo, come un batterio e una pianta e spesso il punto del genoma dell’ospite in cui avviene l’inserimento non è ben definito; poiché i sistemi di regolazione dell’espressione genica nei procarioti – di cui si è dato un esempio nelle diapositive 1-5 – e negli eucarioti sono molto diversi, la resa dell’espressione genica del gene inserito può essere molto problematica; da qui il rendimento molto basso della produzione di piante transgeniche efficienti), sanitari (eventuali, anche se improbabili, reazioni allergiche ai prodotti del gene inserito in piante di uso alimentare; uso massiccio di diserbanti conseguenti all’inserimento di geni che conferiscono la resistenza al diserbante stesso alla pianta coltivata transgenica) bio-ecologici (trasmissione, voluta o incontrollata, del gene inserito in altre popolazioni della stessa specie di piante tramite impollinazione o addirittura in altre specie, per trasposizione con alterazione degli equilibri ecologici; sostituzione di diverse linee di piante coltivate con i nuovi ceppi transgenici, con possibile riduzione della biodiversità) politico-economici (la discutibile e discussa brevettazione degli organismi ingegnerizzati innalza i costi dell’utilizzo di questi organismi e rischia di impoverire ulteriormente i paesi più poveri che ne avrebbero bisogno). Nella diapositiva è illustrata la procedura generale, che verrà descritta più in dettaglio nelle diapositive successive, che consente di inserire il gene di interesse in un batterio: si purifica il DNA della cellula donatrice, si isola il gene che si vuole inserire e lo si inserisce in un plasmide capace di replicare autonomamente, mediante le tecniche del DNA ricombinante; infine si inserisce il plasmide con il gene inserito in un batterio; il batterio contenente il plasmide si duplica, duplicando così anche il plasmide; sul clone di batteri che ne deriva è possibile ottenere copie del gene isolato o della proteina che ne è il prodotto. Copie delle proteine come ad esempio insulina, ormone della crescita Copie del gene isolato Batterio ricombinante duplicazione

7 Enzimi di restrizione Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi capaci di tagliare il DNA producendo rotture a doppia elica in corrispondenza di sequenze specifiche di nucleotidi (siti di restrizione); di essi si servono i batteri per distruggere i cromosomi virali Un taglio è detto adesivo quando: È sfalsato, o sono aggiunti nucleotidi al 3’; I nucleotidi a singolo filamento, sfalsati o aggiunti, sono fra loro complementari endonucleasi Sito di restrizione Tipo di taglio G 5’3’ AATTC Sfalsato, adesivo EcoRI CTTAA G CC GG Tronco, non adesivo HaeIII 5’3’ GG CC Le estremità di un taglio adesivo si possono unire mediante i legami idrogeno tra le basi complementari presenti a singolo filamento sui 2 segmenti di DNA; successivamente, mediante l’azione di ligasi e, se serve, di DNA polimerasi, si saldano i filamenti polinucleotidici (vedere diapositiva 8) Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi batteriche, cioè enzimi capaci di tagliare il DNA a doppia elica su entrambi i filamenti anche lontano dalle estremità della macromolecola; ogni enzima di restrizione riconosce una propria, specifica, breve sequenza (4-6 nucleotidi) di DNA e taglia la doppia elica in quel punto; tali sequenze sono “palindromiche”, cioè la metà della sequenza posta a un lato rispetto al centro dell’intera sequenza è complementare alla sequenza invertita rispetto alla metà della sequenza posta all’altro lato. I tagli possono essere tronchi, non adesivi, cioè i due tagli sui 2 filamenti polinucleotidici avvengono esattamente allo stesso punto, oppure sfalsati, adesivi, cioè i due tagli sui 2 filamenti polinucleotidici avvengono in punti, sfalsati di alcuni nucleotidi. I tagli sfalsati sono adesivi poiché le brevi sequenze a singolo filamento che sporgono dalle due estremità della rottura sono fra loro necessariamente complementari (come si vede nella riga di EcoRI); per questo le 2 brevi sequenze a singolo filamento si possono appaiare di nuovo, tenendo insieme i 2 segmenti di DNA divisi dal taglio; se in queste condizioni si fornisce l’enzima ligasi (vedere serie 4, diapositiva 12), le rotture vengono saldate e si ricostituisce l’integrità della doppia elica. Come è ovvio, se i tagli sono tronchi, dalle estremità di rottura non sporgono brevi sequenze a singolo filamento fra loro complementari, quindi tali estremità di rottura non sono adesive; tuttavia è possibile renderle adesive aggiungendo all’estremità 3’ di un’estremità di rottura una breve sequenza ripetuta dello stesso nucleotide e all’estremità 3’ dell’altra estremità di rottura una breve sequenza ripetuta del nucleotide complementare. Gli enzimi di restrizione, che dai batteri sono utilizzati per distruggere i cromosomi virali, per la loro capacità di tagliare il DNA in punti estremamente specifici e di lasciare estremità di rottura adesive, naturali o artificiali, sono uno strumento potente e versatile per l’ingegneria genetica poiché consentono di tagliare frammenti di DNA, isolarli e inserirli in un altro tratto di DNA. Formazione di code CC AA GG 5’3’ GG TT CC Si possono aggiungere al 3’ di uno dei 2 filamenti di un capo di un taglio tronco, non “adesivo”, una breve sequenza, ripetizione di un solo nucleotide e al 3’ dell’altro capo la sequenza complementare, rendendo adesivo il taglio I siti di restrizione sono brevi sequenze palindromiche: la sequenza posta a un lato rispetto al centro del sito è complementare alla sequenza inversa rispetto a quella posta al lato opposto

8 Mappe di restrizione Una mappa di restrizione consiste nell’identificazione della successione dei siti di restrizione per diverse endonucleasi in un segmento di DNA, misurando la distanza tra i siti come numero di nucleotidi 1) Si esamina un frammento di DNA, marcandolo con 32P al 5’ 2) Si digerisce il frammento con diversi enzimi di restrizione Marcatura con con 32P Siti di restrizione dell’enzima 3) Si stima la lunghezza dei frammenti dallo spazio percorso su un gel mediante elettroforesi Siti di restrizione dell’enzima È possibile mappare i siti di restrizione, cioè i punti riconosciuti e tagliati dagli enzimi di restrizione, di qualunque molecola di DNA (cromosomi, plasmidi, frammenti di diversa lunghezza), identificando la loro sequenza lineare e misurandone le distanze come numero di nucleotidi. La tecnica consiste nella marcatura con l’isotopo radioattivo 32P (vedere sezione 4, dipositiva 6) l’estremità 5’ del filamento polinucleotidico che si vuole esaminare; in questo modo è possibile riconoscere i frammenti di DNA che contengono il radioisotopo mediante la tecnica dell’autoradiografia: si spande un’emulsione fotografica sulla superficie su cui è esposta la molecola da esaminare; in corrispondenza dell’emissione radioattiva l’emulsione si impressiona, rendendo così riconoscibile la posizione della molecola marcata con radioisotopi. I siti di restrizione del filamento di DNA complementare a quello esaminato si trovano negli stessi punti, dato che i siti di restrizione sono gli stessi nei due filamenti polinucleotidici di DNA complementari avvolti a doppia elica; perciò è sufficiente esaminare anche un solo filamento. In questo modo si può misurare la lunghezza di tutti i frammenti che hanno la propria estremità 5’ coincidente con quella del filamento; l’estremità 3’ (non marcata) dei diversi frammenti corrisponderà ai diversi siti di restrizione; misurando la diversa lunghezza dei frammenti del DNA, si misura la distanza (in nucleotidi) del sito di restrizione dall’estremità 5’ marcata; calcolando la differenza fra le lunghezze dei frammenti a 2 a 2, si ottiene la distanza fra i siti di restrizione. L’elettroforesi consiste nello spostamento di una macromolecola in un gel sottoposto a un campo elettrico; l’entità dello spostamento dipende dalla carica, dalla grandezza e dalla struttura tridimensionale della macromolecola; per il DNA, data la distribuzione uniforme della carica e date le condizioni in cui avviene la prova, dipende dalla lunghezza della molecola. Alla fine dell’elettroforesi si identifica la posizione sul gel dei frammenti di DNA che contengono l’estremità 5’ marcata radioattivamente. L’elettroforesi consiste nel collocare le macromolecole in un pozzetto all’estremità di un gel (gelatina) che viene poi sottoposto un campo elettrico; le molecole si spostano con una velocità proporzionale alla propria carica elettrica e inversamente proporzionale lla propria lunghezza; poiché nel DNA la carica è distribuita uniformemente, la velocità dipende solo dalla lunghezza del frammento

9 Il DNA ricombinante VETTORI
DNA da clonare vettore VETTORI Sono cromosomi capaci di replicare e selezionabili, in cui si possono inserire segmenti di DNA di interesse Digestione con endonucleasi DNA polimerasi I + ligasi I vettori possono essere : plasmidi, cromosomi di fagil, ibridi fago-plasmide (cosmidi), tutti capaci di replicarsi in E. coli, YAC, cioè cromosomi artificiali di lievito, capaci di replicarsi in lievito In ogni tipo di vettore si può inserire un frammento di DNA di una particolare lunghezza massima Il termine “ricombinante” assume in questo contesto un significato diverso da quello finora usato; non si tratta più della formazione di nuove combinazioni di alleli, diverse da quelle parentali, cui è dedicata la sezione 2 del corso; si tratta dell’inserimento di un tratto di DNA in un cromosoma; quest’ultimo viene chiamato “vettore” del gene inserito. Un plasmide, o cromosoma fagico (o anche un ibrido fra i 2..) può essere un buon vettore se: è in grado di replicare autonomamente; è selezionabile (p.es. per la resistenza a un antibiotico), in modo che i batteri che lo portano siano gli unici in grado di sopravvivere e proliferare; (eventuale) possiede un sistema di espressione inducibile (simile all’operone descritto nelle diapositive 1-5) adiacente al sito di inserimento del nuovo gene, in modo che, in presenza dell’induttore il nuovo gene inserito venga trascritto (“vettore d’espressione”). Ogni vettore può essere replicato in un proprio gruppo specifico di organismi e può portare segmenti di DNA di una data lunghezza massima. Per inserire un segmento di DNA in un vettore si taglia il DNA dell’organismo donatore del gene da esaminare e quello del vettore con lo stesso enzima di restrizione; si fanno interagire fra loro i frammenti di DNA così ottenuti, dopo avere reso adesive le estremità di rottura del DNA se queste non lo fossero già; le molecole tagliate del vettore si possono legare, mediante le estremità adesive di rottura, a frammenti del DNA dell’organismo donatore del gene, in diverse combinazioni; mediante l’uso di DNA polimerasi I (eventualmente) e ligasi, si saldano le rotture del DNA e in questo modo si possono formare diverse molecole ibride vettore-frammento di DNA del donatore; tra queste si trova la molecola ibrida vettore-sequenza di DNA da esaminare; con le procedure descritte nella diapositiva successiva è possibile a questo punto isolare e identificare quest’ultima molecola. Estremità adesive spontanee o costruite, fra loro uguali Estremità adesive complementari alle precedenti

10 La clonazione del DNA Individuazione dei geni clonati: Southern blotting Genoma da saggiare frammentato con enzimi di restrizione Cromosomi di fago l frammentati 1) Si effettua l’elettroforesi su gel dei frammenti a doppia elica ligasi Genoteca di DNA ricombinante 2) Si denatura il DNA e lo si fa aderire a singolo filamento, nelle stesse posizioni, a un filtro La clonazione del DNA consiste nella produzione di un numero molto alto di copie dello stesso segmento di DNA; anche in questo caso c’è uno slittamento di significato del termine clone; non si tratta più di una popolazione di individui geneticamente identici fra loro (cellule, organismi uni- o pluricellulari) derivati da un unico progenitore per riproduzione asessuata, bensì nell’insieme di segmenti di DNA fra loro identici (le copie del vettore che contiene il gene di interesse) isolati e moltiplicati con la tecnologia del DNA ricombinante. La tecnica consiste nella frammentazione sia del genoma da saggiare che del vettore (nell’esempio della diapositiva il fago temperato lambda), come descritto nella diapositiva precedente. A questo punto si possono seguire 2 strategie alternative: il clonaggio non selettivo: si fanno interagire tutti i frammenti del genoma da saggiare ( in verde i segmenti non interessanti, in azzurro il gene di interesse) con numerose copie del vettore frammentato; mediante ligasi si formano numerosissimi tipi diversi di DNA ricombinante (vettori in cui sono inseriti frammenti diversi); questa collezione costituisce una genoteca del genoma da studiare; si clonano i vettori ricombinanti facendoli crescere in Escheirichia coli; quando si dispone di numerose placche di lisi, ciascuna con il proprio vettore ricombinante, si raccoglie il DNA di ciascuna placca su un filtro, che consente il riconoscimento della posizione occupata nella capsula di coltura; quindi si ibridizza il DNA corrispondente a ciascuna placca con l’mRNA specifico del gene di interesse; solo il DNA che contiene il gene da studiare potrà legare l’RNA radioattivo, per la complementarità dei nucleotidi; in corrispondenza di quel DNA si riscontra quindi la presenza di radioattività mediante autoradiografia; così si può risalire al clone che contiene il gene di interesse e farlo proliferare ulteriormente; il clonaggio selettivo: si effettua un elettroforesi del genoma frammentato (chiamato Southern blotting); dopo l’elettroforesi si denatura il DNA – cioè si separano col calore i due filamenti polinucleotidici - e lo si raccoglie il DNA denaturato di ciascuna banda del gel su un filtro, che consente il riconoscimento della posizione occupata nel gel dell’elettroforesi; quindi si ibridizzano i frammenti del genoma con l’mRNA specifico del gene di interesse; solo il DNA che contiene il gene da studiare potrà legare l’RNA radioattivo, per la complementarità dei nucleotidi; in corrispondenza della banda che contiene quel DNA si riscontra quindi la presenza di radioattività mediante autoradiografia; a questo punto si può recuperare nella posizione giusta sul gel il DNA corrispondente al gene di interesse, lo si fa interagire mediante ligasi con i frammenti del vettore e si ottiene il vettore che include il gene di interesse da potere clonare. Clonazione 3) Si ibridizza con sonda radioattiva complementare al frammento cercato e si effettua l’autoradiografia, localizzando così il gene studiato Ibridazione su filtro con sonda radioattiva complementare al DNA da studiare

11 Sequenziamento SEQUENZIAMENTO DEI NUCLEOTIDI
1) Si marca con 32P l’estremità 5’ del frammento da analizzare, quindi si denatura il DNA 3) Si stima la lunghezza dei frammenti dallo spazio percorso in una corsa elettroforetica 2) Si distruggono selettivamente basi o loro combinazioni (G, G+A, C, C+T), che rendono più fragile il filamento saggiato, che quindi si rompe in quei punti G Il “sequenziamento” di segmenti di DNA, cioè la ricostruzione nucleotide per nucleotide dei suoi filamenti polinucleotidici, è la tecnologia che ha consentito di conoscere la sequenza di interi genomi, incluso quello umano. Si usa la tecnica di marcare con 32P l’estremità 5’ del filamento da studiare, analogamente a quanto fatto per le mappe di restrizione (diapositiva 8); quindi si usano trattamenti chimici in grado di distruggere selettivamente alcune basi (solo G, solo purine – G+A, solo C, solo pirimidine – C+T); questa distruzione indebolisce il filamento polinucleotidico di cui fanno parte le basi distrutte; questo provoca la rottura casuale del filamento in corrispondenza dei siti indeboliti; come conseguenza per ogni trattamento si ottiene una famiglia di frammenti di lunghezza diversa, in ciascuna delle quali casualmente si è verificata la rottura in uno dei siti indeboliti per la distruzione della base (per semplificare, nello schema in basso a sinistra nella diapositiva si è mostrato solo un punto di rottura per ogni base distrutta). Quindi si effettua l’elettroforesi, si raccoglie su filtro il DNA a singolo filamento in modo che vengano conservate le posizioni raggiunte dalle bande di DNA sul gel, si effettua l’autoradiografia per selezionare i filamenti marcati in 5’, si determina la lunghezza in numero di nucleotidi di ogni frammento di DNA marcato, misurando la distanza in nucleotidi fra l’estremità 5’ e il punto di rottura. Così, mettendo in ordine per lunghezza crescente, nucleotide per nucleotide, i diversi frammenti, si ottiene la sequenza esatta di nucleotidi del filamento di DNA analizzato. G G+A C C+T C A T

12 Reazione a catena della polimerasi (PCR)
Taq polimerasi, resistente al caldo Primer 1 Regione complementare a Primer 2 Regione complementare a La reazione a catena della polimerasi, nota con l’acronimo inglese PCR, è una tecnologia che consente di sostituire la clonazione di segmenti di DNA di tipo biologico, tramite inserimento in un vettore e inserimento del vettore in una cellula, con un’amplificazione di tipo biochimico, con l’uso di enzimi in vitro. Si pongono a reagire insieme: un numero limitato di copie del segmento di DNA da amplificare; un numero molto elevato di 2 RNA primer (vedere serie 4, diapositiva 12), complementari ciascuno a una delle 2 estremità 3’ dei 2 filamenti del DNA; l’enzima Taq polimerasi, una DNA polimerasi del batterio Thermus aquaticus, che è un grado di resistere ad alte temperature senza perdere la propria funzionalità; una riserva di nucleotidi delle 4 basi per la sintesi delle nuove catene polinucleotidiche. L’amplificazione consta di numerosi cicli consecutivi; ciascun ciclo consta di: un innalzamento della temperatura che determina la denaturazione del DNA, i cui singoli filmenti si separano; un abbassamento della temperatura che consente alle molecole di RNA primer di appaiarsi ai tratti di DNA all’estremità 3’ di entrambi i filamenti; immediatamente dopo la Taq polimerasi può entrare in azione e sintetizza i nuovi filamenti di DNA, complementari ai 2 filamenti stampo; quando la Taq polimerasi arriva all’estremità 5’ del filamento stampo, sintetizza un tratto di DNA complementare al primer che si trova sull’altro filamento stampo; il primer, contrariamente a quanto avviene per la sintesi del DNA in vivo, non viene rimosso; quindi i filamenti neosintetizzati alla loro estremità 5’ restano costituiti dall’RNA primer, mentre nel resto della loro estensione, fino alla loro estremità 3’, sono costituiti di normali sequenze nucleotidiche di DNA. Alla fine del processo di amplificazione si possono avere milioni di copie a doppia elica del segmento di DNA originario, nelle quali i filamenti polinucleotidici sono costituiti all’estremità 3’ da RNA primer; il numero di copie che si può raggiungere è limitato solo dal umero di molecole di primer e di nucleotidi disponibili al’inizio. Si alternano cicli di denaturazione (a temperatura alta) e di replicazione ( a temperatura bassa), ciascuno dei quali porta un raddoppiamento del numero delle molecole

13 Costruire nuovi geni SINTESI DI SEQUENZE NON SU STAMPO:
è possibile allungare filamenti di DNA al 5’ aggiungendo nucleotide dopo nucleotide costruendo oligonucleotidi di sequenza voluta INDUZIONE DI MUTAZIONI SPECIFICHE 3) Si modificano specifici nucleotidi sul filamento rimasto; dopo la replicazione, anche il nuovo filamento sarà mutato nello stesso sito 1) Si rompe il DNA con endonucleasi La costruzione di nuove sequenze di DNA, senza partire da sequenza stampo, è possibile a partire da brevi filamenti polinucleotidici di DNA, allungandoliall’estremità 5’ (nel verso opposto rispetto alla replicazione biologica del DNA) con l’aggiunta, uno per uno, di nuovi nucleotidi mediante complesse procedure chimiche; in questo modo è possibile costruire filamenti oligonucleotidici, o oligonucleotidi (cioè composti di pochi nucleotidi, meno di cento); inserendo gli oligonucleotidi con i metodi descritti in altri segmenti di DNA, si possono costruire nuovi geni. L’induzione di mutazioni geniche programmate, cioè la sostituzione di basi con altre basi specifiche nel sito desiderato, consente la produzione di nuovi alleli (mutagenesi mirata, sito specifica). La procedura è la seguente: si taglia il segmento di DNA di interesse, già opportunamente clonato su un vettore, con un enzima di restrizione adatto, che abbia il suo sito di restrizione vicino al sito che si vuole fare mutare; si digerisce blandamente uno dei 2 filamenti di DNA della doppia elica a partire dalle 2 estremità 3’ dei 2 capi di rottura, in modo da lasciare brevi tratti del DNA a singolo filamento all’estremità 5’; si modifica mediante trattamento chimico il nucleotide bersaglio (per esempio si rimuove un radicaleaminico - sezione 4, diapositiva – dalla citosina, in modo che la base modificata si appai con l’adenina invece che con la guanina); mediante DNA polimerasi I (che non ha bisogno di RNA primer), si ricostituiscono i filamenti polinucleotidici digeriti in precedenza; in corrispondenza del nucleotide modificato, verrà incorporato, sul nuovo filamento, un nucleotide diverso da quello che occupava la stessa posizione nel filamento digerito, complementare al nucleotide modificato; mediante ligasi si ricostituisce l’integrità del vettore, che ore ha inserito, in modo stabile, un allele mutante del gene di interesse. 2) Si digeriscono singoli filamenti in direzione 5’ con esonucleasi