Ceppo S ucciso dal calore

Presentazione sul tema: "Ceppo S ucciso dal calore"— Transcript della presentazione:

1 Ceppo S ucciso dal calore
La trasformazione batterica: batteri (Streptococcus pneumoniea) avirulenti (ceppo R) sono trasformati in batteri virulenti (ceppo S) da batteri virulenti (ceppo S) uccisi dal calore Ceppo S Ceppo R Uccisione con il calore Ceppo S ucciso dal calore Ceppo S proteine lipidi polisaccaridi RNA Nessuna trasformazione Ceppo R La trasformazione batterica è una delle modalità della ricombinazione occasionale che si realizza nei procarioti (vedere sezione 2); consiste nell’acquisizione di frammenti di cromosomi di batteri morti da parte di batteri vivi, cui consegue, mediante un numero pari di crossing over (vedere sezione 2) l’incorporazione di alcuni geni del frammento di cromosoma incorporato al posto dei geni corrispondenti del cromosoma del batterio vivo. In esperimenti successivi tra gli anni 20 e gli anni 40 del secolo scorso, dapprima Griffith, quindi Avery, McLeod e McCarty identificarono la natura chimica dei geni studiando la trasformazione batterica in Pneumacoccus pneumonia. Il ceppo S, virulento, cioè capace di infettare, uccide i topi in cui è inoculato provocando una polmonite acuta; invece il ceppo R, avirulento, cioè incapace di infettare, non ha alcun effetto sui topi in cui è inoculato. Se si uccidono con il calore batteri del ceppo S, virulento e li si inietta nei topi, i topi rimangono sani; se invece si iniettano nei topi batteri del ceppo S uccisi dal calore insieme a batteri vivi del ceppo R, i topi si ammalano e muoiono. I batteri del ceppo S, morti, hanno trasformato i batteri vivi di ceppo R in batteri di ceppo S, quindi capaci di infettare e uccidere i topi. La capacità trasformante dei batteri di ceppo S morti si mantiene anche se essi vengono disgregati, ottenendo una miscela delle sostanze di .cui il batterio è costituito. Trattando la miscela con enzimi capaci di demolire proteine, grassi, polisaccaridi ed RNA (vedere di seguito), la miscela mantiene la capacità trasformante; trattando la miscela con enzimi capaci di demolire il DNA (vedere di seguito), la miscela perde la capacità trasformante. Questa è stata la prima volta che si è identificata nel DNA la natura chimica dei geni e dei cromosomi. Ceppo S Ceppo R DNA trasformazione trasformazione

2 L’infezione di cellule del batterio Escheirichia coli da parte del fago T2 avviene mediante il DNA del virus, non mediante le sue proteine 32P La radioattività (e il DNA) entra Solo nel DNA Hershry e Chase, negli anni 50, procedettero all’infezione del batterio Escheirichia coli con il fago T2. In 2 esperimenti successivi marcarono con isotopi radioattivi le 2 componenti del virus: le proteine furono marcate con 35S, radioisotopo dello zolfo, che entra nella composizione delle proteine come costituente dell’aminoacido cisteina; il DNA con 32P, radioisotopo del fosforo che entra nella composizione del DNA entrando a far parte del radicale fosfato che unisce 2 nucleotidi successivi (vedere: diapositiva 8). L’infezione fu condotta con un alto numero di virus in modo che ogni cellula batterica fosse infettata da molti virus. Dopo il tempo necessari per l’adesione delle capsule virali alle pareti batteriche e all’iniezione dei cromosomi virali, con trattamento meccanico furono staccate le capsule virali dalle pareti batteriche e si è verificato quale radioisotopo fosse entrato con il cromosoma virale e quale fosse rimasto fuori con la capsula. Risultò che 32P entra nella cellula batterica, a dimostrazione che il cromosoma virale è costituito da DNA, mentre 35S rimane fuori, a dimostrazione che la capsula virale è costituita da proteine. Da questo momento in poi, accertato che il DNA è la molecola che costituisce i geni e i cromosomi, le ricerche si sono volte a capire quali proprietà del DNA potessero spiegare il ruolo di questa molecola nell’eredità. 35S Solo nelle proteine La radioattività (con le proteine) non entra

3 Le basi azotate ..... ......... ........ .......... H O + - C - +
N O Timina N C H Adenina Pirimidine ..... Citosina H C N O N C H O Guanina Il DNA è costituito da 3 tipi di molecole diverse: le basi azotate, uno zucchero, il desossiribosio, e l’acido fosforico che caratterizza come acido il DNA. Mentre l’acido fosforico e il desossiribosio sono in quantità costante, le basi azotate sono in quantità variabile tra loro. Le basi azotate sono molecole ad anello chiuso (cicliche) con ossatura di carbonio e azoto; si dividono in 2 tipi diversi: le pirimidine, costituite da una molecola a un solo ciclo, esagonale e le purine, costituite da una molecola a 2 cicli, uno pentagonale e uno esagonale, con un lato in comune. Le due purine, adenina e guanina, differiscono di poco fra loro, come le due pirimidine, timida e citosina; nella diapositiva è data una descrizione semplificata delle molecole che ne sottolinea gli aspetti funzionali. L’atomo di carbonio in giallo fa parte del desossiribosio (numerato come C1) e garantisce, mediante il legame con un atomo di azoto delle basi azotate, la connessione di queste ultime con il resto della molecola. La carica elettrica non si distribuisce in modo uniforme nelle basi azotate; in particolare gli atomi di idrogeno rappresentati assumono una carica positiva, gli atomi di ossigeno e azoto una carica negativa. Mediante l’attrazione tra le cariche positive di una specifica base con quelle negative di una specifica base di tipo diverso, si possono creare legami deboli, chiamati legami idrogeno, per il ruolo che vi svolge questo atomo, facili da costruire e da sciogliere, che consentono di unire le basi a 2 a 2; questa interazione è possibile sempre tra una specifica purina e una specifica pirimidina: tra l’adenina e la timina (2 legami idrogeno) e tra la guanina e la citosina (3 legami idrogeno); le basi in grado di istituire tra loro i legami idrogeno sono dette basi complementari. Purine

4 La struttura del DNA H HO H2C5’ O BASE ….. C4’ C3’ C2’ C1’ P O- C G
Legami idrogeno Legami idrofobici T A P 1’ 5’ 3’ P 5’ 3’ 1’ L’insieme della base azotata con il desossiribosio, legati attraverso il C1 del desossiribosio costituisce un nucleoside; quando un nucleoside si lega attraverso il proprio atomo di carbonio C5 a una molecola di acido fosforico ne risulta il corrispondente nucleotide, come si vede nello schema a sinistra della diapositiva. Se l’acido fosforico di un nucleotide si lega anche a uno specifico atomo di carbonio, C3, di un altro nucleotide, si ottiene un dinucleotide; legando molti nucleotidi fra loro in sequenza lineare, in cui l’acido fosforico si lega al C5 di una molecola di desossiribosio e al C3 della molecola successiva di desossiribosio, si ottiene una catena polinucleotidica, come si vede nello schema in basso a destra della diapositiva. Due catene polinucleotidiche antiparallele – cioè che abbiano il verso opposto rispetto alla sequenza C3-C5 – che presentino affacciate in ogni punto basi complementari (vedere anche la diapositiva precedente), possono istituire fra loro una lunga serie di legami idrogeno che le tengono unite; nello schema in basso a destra la catena polinucleotidica di destra presenta il C5 di ogni nucleotide verso l’alto, quindi la polarità C3-C5 (indicata anche come 3’-5’) è diretta verso l’alto, mentre la catena polinucleotidica di destra presenta il C5 di ogni nucleotide verso il basso, quindi la polarità C3-C5 (indicata anche come 3’-5’) è diretta verso il basso. La principale conseguenza di questo modello è che le due intere sequenze polinucleotidiche sono interamente complementari, coppia di basi per coppia di basi, per potere rimanere unite in un doppio filamento; le basi sono, anche per questo, all’interno del doppio filamento che risulta dall’appaiamento delle catene polinucleotidiche complementari; all’esterno invece ci sono alternate le 2 ossature costituite da desossiribosio e acido fosforico alternati. Per potere comprendere appieno il modello occorrono 2 ultime precisazioni: 1) Le coppie di basi complementari, che possiamo paragonare a mattonelle prismatiche, presentano il piano delle loro molecole ortogonale all’asse del doppio filamento: continuando il paragone con le mattonelle, guardando di lato il doppio filamento vediamo il lato delle basi azotate (animazione dello schema in basso a destra). 2) Le due ossature desossiribosio – acido fosforico sono avvolte a elica intorno all’asse del doppio filamento (animazione dello schema in basso a destra) per cui il doppio filamento polinucleotidico ha una struttura a doppia elica. Il modello della doppia elica si può assimilare a una scala a chiocciola, in cui i gradini sono le coppie di basi appaiate e le ringhiere (un po’ bassine…) sono le ossature desossiribosio – acido fosforico. Nucleotide Il DNA è costituito da due catene polinucleotidiche antiparallele avvolte tra loro a doppia elica

5 Il modello della doppia elica del DNA
Conoscenze preesistenti: il DNA è un polimero costituito da un numero molto elevato di subunità: i nucleotidi (fosfato + desossiribosio + 1 base azotata) Dati chimici: 1) Le molecole puriniche sono nello stesso numero delle molecole pirimidiniche (A+G=T+C); 2) Ciascuna delle molecole puriniche ha una e una sola molecola pirimidinica in uguale numero e precisamente: A=T, G=C Dati cristallografici: la figura ottenuta dalla diffrazione dei raggi x suggeriva che il DNA è una lunga molecola lineare, costituita a due filamenti paralleli avvolti a doppia elica Ammettendo che le basi azotate si trovino all’interno della doppia elica, solo l’affacciamento di una purina con una pirimidina garantiscono il diametro realmente riscontrato della doppia elca Questa diapositiva sottolinea il contributo originale di Crick e Watson, che proposero il modello della doppia elica fondato sull’appaiamento mediante i legami idrogeno delle basi complementari, a partire dalle conoscenze preesistenti (il DNA come polimero costituito da un numero molto elevato di nucleotidi, le risultanze cristallografiche che suggerivano per il DNA una struttura a 2 filamenti avvolti a doppia elica, i rapporti quantitativi fra le basi – ci sono tante purine quante pirimidine, ci sono tante adenite quante timine, tante guanine quante citosine); il modello presentato era in accordo con tutte le conoscenze preesistenti e permetteva di prevedere una modalità di replicazione del DNA, mediante la separazione dei 2 filamenti polinucleotidici e la formazione di 2 nuovi filamenti complementari, attraverso l’incorporazione progressiva dei nuovi nucleotidi. Questa modalità di replicazione del DNA, estremamente precisa, consentiva di spiegare la duplicazione dei cromosomi e l’esattezza della trasmissione ereditaria. Originalità del modello di Crick e Watson: la complementarità di coppie di basi (una purina e una pirimidina) che con i loro legami idrogeno stabilizzano la struttura a doppia elica e che, mediante la separazione dei due filamenti polinucleotidici e l’incoprorazione di nucleotidi complementari sullo stampo dei filamenti preesistenti, garantiscono la precisione della replicazione del DNA e la correttezza della trasmissione ereditaria

6 Replicazione semiconservativa: l’esperimento di Meselson e Sthal
Centrifugazione di DNA in gradiente di cloruro di cesio. Le colture cresciute per molte generazioni in un terreno contenente 15N e 14N forniscono le posizioni di controllo per le bande di DNA “pesante “ e “leggera”. Quando le cellule fatte crescere in 15N vengono trasferite in un terreno 14N, la prima generazione produce una banda di DNA intermedia e la seconda produce due bande, una intermedia e una leggera. Prima generazione Seconda generazione Incubazione di cellule pesanti in 14N 15N 14N controlli Bande di DNA “pesante e “leggera” 15N14N Solo il modello semiconservativo di replicazione di DNA spiega questi risultati conservativa Una banda intermedia tra 15N14N e 14N14N dispersiva Una banda 15N14N Due bande N15N e 14N14N Replicazione semiconservativa Uno dei punti più importanti del modello della doppia elica del DNA consisteva nel prevedere una modalità della replicazione del DNA capace di spiegarne l’assoluta fedeltà e, di conseguenza, la capacità di garantire con precisione la trasmissione dei geni ad ogni divisione cellulare e ad ogni generazione di individui pluricellulari. Meselson e Stahl, alla fine degli anni 50 del secolo scorso, progettarono un esperimento in grado di discriminare tra 3 ipotesi alternative sulle modalità di replicazione del DNA 1. replicazione semiconservativa (schema grande, in basso a sinistra nella diapositiva): a partire dalla doppia elica di DNA che funge da stampo (in nero), si ipotizza che i 2 filamenti polinucleotidici di essa, antiparalleli (vedere le punte delle frecce) e complementari fra loro, si separino per fungere da “stampo” per sintetizzare i nuovi filamenti polinucleotidici (in rosso), a loro volta antiparalleli e complementari rispetto ai filamenti stampo (in nero), a partire dai singoli nucleotidi presenti nelle cellule; alla fine della replicazione, al posto della doppia elica originaria (con 2 filamenti neri) ci sono 2 doppie eliche “ibride”, ciascuna con un filamento vecchio (nero) e uno nuovo (rosso). 2. replicazione conservativa (1° schema piccolo in basso a destra): i 2 filamenti vecchi (neri), dopo avere funzionato da stampo, si disimpegnano dai filamenti nuovi e tornano a formare una doppia elica “vecchia”, mentre i 2 filamenti “nuovi (rossi) si avvolgono a formare una doppia elica “nuova”. 3. replicazione dispersiva (2° schema piccolo in basso a destra): le doppie eliche si frammentano e, successivamente, si risaldano in modo che i filamenti polinucleotidici sono un mosaico di segmenti vecchi e nuovi. I 2 autori riuscirono a rendere distinguibili i filamenti di DNA vecchi da quelli nuovi agendo sul peso delle molecole; infatti fecero crescere per molte generazioni batteri Escheirichia coli in un terreno che conteneva un isotopo stabile, pesante dell’azoto: 15N (l’isotopo normale è il meno pesante 14N). Quindi le doppie eliche dei batteri, dopo molte generazioni in presenza di 15N, erano composte di 2 filamenti “pesanti”, ed erano quindi, a loro volta, pesanti. Per confronto, fecero crescere per molte generazioni altri batteri Escheirichia coli in un terreno che conteneva l’isotopo stabile, normale dell’azoto, 14N; le doppie eliche di questi batteri, dopo molte generazioni, erano composte di 2 filamenti “leggeri”, ed erano quindi, a loro volta, leggere. Lo strumento per pesare le macromolecole è l’ultracentrifuga: più le molecole sono pesanti, più vanno verso il fondo delle provette; colorando il DNA in modo adeguato, si può osservare una banda colorata in ogni provetta in corrispondenza del livello da esso raggiunto; il DNA “leggero” costituisce una banda tipica, lontana dal fondo della provetta; il DNA “pesante” costituisce un’altra banda tipica, vicina al fondo della provetta (vedere lo schema in alto a sinistra nella diapositiva). Dopo essere stati fatti crescere per molte generazioni in presenza di 15N, in modo che le doppie eliche fossero composte di 2 filamenti “pesanti”, i batteri furono a questo punto fatti crescere in un terreno che conteneva 14N, in modo che, da quel momento, tutti i nuovi filamenti polinucleotidici del DNA fossero “leggeri”; dopo la durata di 1 e 2 generazioni dei batteri nel nuovo terreno di coltura, fu estratto il loro DNA e fu ultracentrifugato: dopo 1 generazione si formava una sola banda di DNA con peso intermedio, a testimonianza che nella doppia elica metà del DNA conteneva15N e l’altra metà14N; questo primo risultato esclude il modello della replicazione conservativa, che, prevedendo la formazione di una doppia elica vecchia e una nuova, prevede di conseguenza la formazione di 2 bande di DNA, dopo 1 generazione cellulare: una banda pesante e una leggera; dopo 2 generazioni, invece, si formavano 2 banda di DNA: una con peso intermedio, a testimonianza che nella doppia elica metà del DNA conteneva 15N e l’altra metà 14N; l’altra “leggera”, a testimonianza che nella doppia elica tutto il DNA conteneva 14N questo risultato esclude il modello della replicazione dispersiva, che, prevedendo la frammentazione delle doppie eliche, prevede di conseguenza la formazione di 1 banda di DNA, dopo 2 generazioni cellulari, in una posizione a metà strada fra la banda intermedia e quella leggera. Così fu verificata l’ipotesi della replicazione semiconservativa del DNA. Una banda 15N14N Due bande N14N e 14N14N

7 Replicazione semiconservativa del DNA nei cromosomi degli eucarioti
BrUdR Blocco della M1 con colchicina G1 S G2 Mitosi (M1) 2n BrUdR Alla fine degli anni 50 Taylor e, in modo più elegante, Wolf 15 anni più tardi verificarono anche per i cromosomi degli eucarioti l’ipotesi della replicazione semiconservativa. In questa diapositiva è illustrato l’esperimento di Wolf; in questo caso i filamenti polinucleotidici vecchi si distinguono da quelli nuovi per composizione chimica. I termini G1, S e G2 si riferiscono alle 3 fasi dell’interfase del ciclo cellulare degli eucarioti: G1 precede la replicazione del DNA, G2 la segue, la replicazione ha luogo in S. Si fornisce alle cellule una base azotata simile alla timina, il 5-bromo-uracile, come nucleoside, capace di essere incorporato nel DNA (nella diapositiva: BrUdR); gli enzimi della cellula non riconoscono la differenza tra timida e 5-bromo-uracile, e incorporano quest’ultimo al posto della timina nei nuovi filamenti polinucleotidici (i filamenti con timina sono azzurri, nella diapositiva; quelli con 5-bromo-uracile celesti). Una particolare colorazione con il reagente Giemsa, che fa uso anche di radiazione ultravioletta, conferisce un colore scuro, ben visibile alle regioni cromosomiche in cui è presente la timina, mentre è molto pallido il colore delle regioni che ne sono prive. Nella prima mitosi dopo l’inizio della somministrazione del 5-bromo-uracile (M1), ognuno dei 2 cromatidi fratelli di ciascun cromosoma è costituito di una doppia elica ibrida, in base all’ipotesi della replicazione semiconservativa del DNA; pertanto ognuno dei 2 cromatidi fratelli avrà un filamento polinucleotidico vecchio, con timina e uno nuovo, con 5-bromo-uracile; la presenza di timina in proporzioni simili e in abbondanza in entrambi i cromatidi fratelli di ciascun cromosoma produce in entrambi una colorazione scura e ben visibile. Se si somministra il 5-bromo-uracile anche per un secondo ciclo cellulare (schema nella riga in basso nella diapositiva), nella seconda mitosi (M2), in base all’ipotesi della replicazione semiconservativa del DNA, uno solo dei 2 cromatidi fratelli avrà un filamento polinucleotidico vecchio, con timina e uno nuovo, con 5-bromo-uracile; l’altro avrà 2 filamenti con 5-bromo-uracile; la presenza di timina in uno solo dei 2 cromatidi fratelli determina una colorazione scura e intensa in questo cromatidio, mentre l’altro mostra una colorazione pallida. In effetti queste modalità di colazione sono quelle effettivamente osservate nelle 2 mitosi, quindi risulta confermata l’ipotesi della replicazione semiconservativa del DNA. G1 S G2 Mitosi (M2) 4n

8 La forca replicativa DNA ligasi DNA polimerasi I girasi elicasi SSB
primasi RNA primer DNA polimerasi III lagging strand leading strand 5’ 3’ Lo studio della forca replicativa, effettuato con particolare cura in Escheirichia coli, mette in luce alcuni fattori essenziali della replicazione del DNA: 1. i nucleotidi liberi, che saranno incorporati nel nuovo filamento polinucleotidico, hanno la propria molecola di acido fosforico legato al carbonio 5 del proprio desossiribosio; questa molecola di acido fosforico si lega anche al carbonio 3 del desossiribosio dell’ultimo nucleotide che si è già legato al filamento polinucleotidico che si sta allungando (schema in alto a sinistra nella figura); quando un nuovo nucleotide viene incorporato in questo modo nel filamento che si sta allungando, presenta a sua volta il carbonio 3 disponibile al legame con l’acido fosforico del nucleotide successivo: quindi il filamento in allungamento presenta sempre un carbonio 3 libero; l’accrescimento del filamento avviene in una direzione sola, quella della propria estremità in cui si trova il carbonio 3 libero; in modo sintetico si dice che il filamento si allunga in direzione 3’; 2. grazie all’azione di diversi enzimi (la girasi che srotola la doppia elica che deve replicare, l’elicasi che separa i 2 filamenti “vecchi”, la proteina SSB che mantiene separati i filamenti) i due filamenti vecchi del DNA si separano e possono funger da “stampo” per l’imminente replicazione; 3. per innescare la replicazione del DNA deve essere sintetizzato un piccolo segmento di RNA, detto “primer”, grazie all’azione di un altro enzima, la primasi, sullo stampo dei filamenti “vecchi” di DNA; 4. grazie all’azione dell’enzima DNA polimerasi III i filamenti nuovi vengono sintetizzati sullo stampo di quelli vecchi e si accrescono nella direzione del proprio 3’; 5. dato che per entrambi i filamenti nuovi l’allungamento avviene in direzione 3’, uno dei 2 filamenti nuovi si allunga nella stessa direzione di spostamento della forca replicativa, mentre l’altro si allunga nella direzione opposta; il primo cresce velocemente, in modo continuo, senza interruzioni, a partire da un solo primer (leading strand), mentre il secondo cresce lentamente, in modo discontinuo, per segmenti (i frammenti di Okazaki), a partire da numerosi primer; 6. per rimuovere i primer e ultimare la replicazione del DNA interviene l’enzima DNA polimerasi I; per saldare i filamenti nuovi nei punti in cui era presene il primer, in particolare per i frammenti di Okazaki, interviene l’enzima ligasi. frammento di Okazaki

9 struttura primaria: sequenza lineare degli aminoacidi
Aminoacidi e proteine struttura primaria: sequenza lineare degli aminoacidi legame peptidico R R’ HO HO struttura secondaria: avvolgimenti o ripregamenti elementari della catena polipeptidica, dovuti a legami idrogeno tra aminoacidi vicini nella sequenza lineare C C NH NH2 C C NH2 H2O O O H H aminoacido 1 aminoacido 2 dipeptide a elica foglietto b struttura quaternaria: composizione di più catene polipeptidiche, uguali o diverse, a formare una proteina multimerica struttura terziaria: struttura tridimensionale della catena polipeptidica dovuta alle interazioni fra aminoacidi anche lontani nella sequenza lineare È necessaria una piccola digressione nel campo della biochimica: infatti tutti gli enzimi sono proteine, talvolta legate ad altre piccole molecole. Dunque occorre qualche cenno sulla struttura delle proteine. Le proteine sono costituite da una o più catene polipeptidiche; una catena polipeptidica è costituita da una sequenza lineare di aminoacidi; gli aminoacidi sono piccole molecole con ossatura di carbonio, caratterizzate dalla presenza di un radicale carbossilico (COOH), con caratteristiche acide e di un radicale amminico (NH2), con caratteristiche basiche; R ed R’ indicano l’ossatura di carbonio e gli atomi ad essa legati che caratterizzano i diversi aminoacidi (in natura ce ne sono 20). Il radicale amminico di un aminoacido e il radicale carbossilico di un altro possono reagire espellendo una molecola d’acqua e creando un legame forte fra i due aminoacidi, il legame peptidico (CO-NH); così si forma un dipeptide; è possibile aggiungere via via altri aminoacidi e formare catene lineari di 3, 4 o più aminoacidi, tutti legati a 2 a 2 da legami peptidici; il risultato è una catena polipeptidica. Poiché ogni aminoacido ha solo un radicale carbossilico e solo un radicale amminico disponibili per il legame peptidico, le catene polipeptidiche non sono ramificate e sono costituite da una sequenza lineare di aminoacidi; questa sequenza costituisce la struttura primaria della catena polipeptidica. Le catene polipeptidiche possono piegarsi (foglietti beta) o avvolgersi a elica (eliche alfa), come conseguenza delle interazioni deboli (legami idrogeno o idrofobici) fra aminoacidi vicini nella catena; questo livello di organizzazione è definito struttura secondaria; su una scala più ampia la catena polipeptidica può subire diversi piegamenti che le danno una conformazione tridimensionale, grazie a legami fra aminoacidi anche lontani tra loro nella sequenza lineare; si tratta della struttura terziaria; infine possono interagire tra loro 2 o più catene polipeptidiche, fra loro uguali o diverse; si tratta della struttura quaternaria; l’esempio nella diapositiva è il più semplice: interagiscono 2 polipeptidi uguali a formare un omodimero (cioè una macromolecola costituita da 2 parti, uguali fra loro); l’emoglobina umana degli adulti per la sua struttura quaternaria è costituita da due catene polipeptidiche alfa e due catene beta. Le strutture secondaria, terziaria e quaternaria sono in ultima analisi una conseguenza della struttura primaria; perciò quello che controlla la struttura primaria delle catene polipeptidiche controlla la funzionalità delle proteine e, fra queste, degli enzimi. C N In ultima analisi le strutture secondaria, terziaria e quaternaria sono dovute alla struttura primaria omodimero

10 Un gene una catena polipeptidica
Frammentando progressivamente un polipeptide, è possibile averne un’impronta digitale (fingerprinting) attraverso lo spostamento dei frammenti in 2 diversi solventi: così è possibile identificare il frammento che differisce fra l’allele normale e quello mutato, fino a individuare l’aminoacido cambiato Alleli diversi possono differire per la sostituzione di un solo aminoacido in una catena polipeptidica Nella catena b dell’emoglobina umana, l’aminoacido in posizione 6 è l’acido glutammico nell’allele normale dell’emoglobina A (HbA) ed è la valina nell’allele mutato dell’emoglobina S (HbS) Colinearità tra gene e catena polipeptidica Mediante l’analisi di cotrasduzione con il fago P1, si sono mappate diverse mutazioni in diversi siti del gene TrpA (per la sintesi del triptofano) in Escheirichia coli Se un gene determina la struttura e la funzione di un enzima e se un enzima è una proteina – eventualmente integrata da una piccola molecola non proteica – e se le strutture quaternaria, terziaria e secondaria di una proteina sono decise dalla struttura primaria delle catene polipeptidiche che la costituiscono, cioè dalla loro sequenza lineare di aminoacidi, allora diventa indispensabile capire se alleli diversi di uno stesso gene determinano strutture primarie diverse delle catene polipeptidiche da esso codificate. La presente diapositiva illustra la tecnica del “fimgerprinting” (impronte digitali) mediante la quale, frammentando una catena polipeptidica in frammenti sempre più piccoli, fino ai singoli aminoacidi, utilizzando in sequenza diversi enzimi proteolitici, cioè capaci di frammentare le proteine, è possibile identificare la composizione in aminoacidi dei frammenti e dell’intera catena. I frammenti e, successivamente, gli aminoacidi, vengono separati mediante la loro diffusione passiva in 2 solventi che a loro volta si diffondono a partire da 2 lati ortogonali di un foglio di carta bibula. Si colloca la miscela di aminoacidi ( o i frammenti) in un angolo; questi si diffonderanno a seguito dell’affinità chimica con il primo solvente (p. es. se è un solvente grasso, si muoveranno più facilmente gli aminoacidi solubili nel grasso (lipofili)); quando si aggiunge il secondo solvente gli aminoacidi saranno già scaglionati su un lato del foglio; gli aminoacidi cominciano a muoversi in una direzione ortogonale a quella precedente secondo l’affinità con il 2° solvente; ne consegue una disposizione sul foglio a macchia di leopardo, caratteristica di ciascun frammento o di ciascuna catena polipeptidica. In questo modo è possibile distinguere due frammenti che differiscono per un solo aminoacido: nello schema della diapositiva si analizza un frammento di 7 aminoacidi: 2 celesti, 2 gialli, uno rosa, uno grigio e uno rosso (ogni colore rappresenta per convenzione un aminoacido diverso: ovviamente la colorazione reale è uguale per tutti gli aminoacidi); separando i 7 aminoacidi appartenenti a 5 tipi diversi, si ottiene l’impronta digitale descritta dalla prima schermata (una macchia celeste, una rossa, una gialla, una grigia e una rosa); se si prende un frammento in cui è avvenuta la sostituzione di un singolo aminoacido, compare una nuova “impronta digitale”, in cui è scomparsa la macchia “rossa” e, in una posizione diversa, è comparsa la macchia “verde”. Mediante l’analisi delle impronte digitali di diverse catene polipeptidiche si è spesso verificato che la catena polipeptidica governata da uno specifico gene presenta forme alternative, ciascuna determinata da un allele diverso, che differiscono per la sostituzione di un singolo aminoacido e che spesso le mutazioni geniche hanno come risultato la sostituzione di un singolo aminoacido in una catena polipeptidica. Particolarmente famoso è il caso dell’anemia falciforme umana, scoperto con il metodo del fingerprinting negli anni 50 del secolo scorso: l’allele del gene per la catena beta dell’emoglobina che, in omozigosi, determina l’anemia falciforme (HbS), differisce dall’allele normale (HbA)per la sostituzione di un singolo aminoacido: nella posizione 6 della catena polipeptidica beta l’aminoacido acido glutammico è sostituito dall’aminoacido valina; questa singola sostituzione di aminoacido produce effetti fenotipici devastanti, in omozigosi (ma in eterozigosi rende più resistenti alla malaria). Studiando con il metodo del figerprinting il polipeptide prodotto dal gene Trp A, per la produzione dell’aminoacido triptofano, nel batterio Escheirichia coli, Yanofsky, negli stessi anni, localizzò diverse sostituzioni di aminoacidi in diverse posizioni della catena polipeptidica A dell’enzima triptofano sintetasi, corrispondenti a diversi alleli di quel gene; nella diapositiva sono indicate solo alcune di queste sostituzioni: in posizione 15 la lisina è sostituita da un segnale di stop (interruzione della catena polipeptidica: vedere diapositiva (18); in posizione 22 la fenil alanina è sostituita dalla leucina; in posizione 49 l’acido glutammico è sostituito dalla valina, dalla glutammica o dalla metionina; in posizione 175 la fenil alanina è sostituita dalla cisteina. Facendo la mappa genetica dei diversi alleli di cui aveva identificato le sostituzioni di specifici aminoacidi in specifiche posizioni, Yanofsky scoprì che l’ordine nella sequenza lineare degli alleli nel gene coincide con l’ordine delle posizioni degli aminoacidi sostituiti nella catena polipeptidica: in altre parole il gene e la catena polipeptidica da esso codificata sono colineari; invece non sono fra loro proporzionali le distanze tra i siti mutati nel gene, misurati come frequenza di ricombinazione e tra gli aminoacidi sostituiti, misurati come numero di posizioni interposte nella catena polipeptidica (vedere lo schema a destra nella diapositiva. L’interpretazione data consistette nella probabilità non uniforme di crossino over tra i diversi siti mutabili del gene. Mediante l’analisi di fingerprinting si sono localizzati, nella catena polipeptidica, le posizioni degli aminoacidi caratteristici di ciascuna mutazione mappata N 15: Lys->STOP; 22: Phe->Leu; 49: Glu->Val,Gln,Met; 175: Tyr->Cys. La sequenza dei siti mutati nel gene è identica alla sequenza delle posizioni degli aminoacidi sostituiti, anche se le distanze non corrispondono esattamente

11 Filamenti di RNA non ibridato
Struttura dell’RNA H HO H2C5’ O BASE ….. C4’ C3’ C2’ C1’ P O- RNA compl. DNA A A C G T desossiribosio ribosio G C U OH P 5’ 3’ 1’ H 1 C H La sintesi delle proteine, a partire dall’informazione contenuta nel DNA, richiede l’intermediazione di un’altra macromolecola: l’RNA. L?RNA ha la stessa struttura di filamenti polinucleotidici del DNA, con alcune differenze: 1. lo zucchero dell’RNA è il ribosio, che è identico al desossiribosio salvo per il fatto che possiede un radicale –OH al posto di un –H legato al carbonio 2; 2. tra le basi azotate, l’adenina, la guanina e la citosina sono comuni al DNA e all’RNA, mentre nell’RNA al posto della timina, presente nel DNA, c’è l’uracile, che presenta legato al carbonio 5 dell’anello pirimidinico un radicale –H invece di un radicale –CH3; 3. l’RNA non presenta una struttura a doppia elica. L’RNA viene sintetizzato partendo dallo stampo del DNA secondo le regole della complementarità delle basi; nel punto in cui sul filamento del DNA è presente la timina, sull’RNA andrà l’adenina; nel punto in cui sul filamento del DNA è presente l’adenina, sull’RNA andrà l’uracile; nel punto in cui sul filamento del DNA è presente la guanina, sull’RNA andrà la citosina; nel punto in cui sul filamento del DNA è presente la citosina, sull’RNA andrà la guanina. Il ruolo dell’RNA è stato suggerito da diversi esperimenti: somministrando a cellule di eucarioti precursori radioattivi dell’RNA, come l’uracile marcato con il tritio (3H), si è osservato che dapprima la marcatura si localizza nel nucleo, a suggerire la sintesi dell’RNA sullo stampo del DNA; successivamente si localizza nel citoplasma, a suggerire la migrazione delle molecole neoformate dell’RNA nei luoghi in cui si realizza la sintesi proteica; sempre mediante la somministrazione di precursori radioattivi, si è visto che filamenti nuovi di RNA si spostano sui cromosomi crescendo in lunghezza, a suggerire l’allungamento progressivo dei filamenti di RNA man mano che venivano “copiate” regioni successive del gene. Poiché il processo di sintesi dell’RNA avviene senza cambiare “linguaggio” (si tratta sempre di sequenze polinucleotidiche) e poiché avviene con estrema precisione, ha avuto il nome di “trascrizione”. È possibile fare delle doppie eliche ibride DNA/RNA, purchè quest’ultimo presenti una sequenza complementare rispetto a uno dei 2 filamenti della doppia elica del DNA; è infatti possibile “denaturare” il DNA, cioè separare i 2 filamenti mediante alte temperature (più di 60°C); se si aggiunge al DNA denaturato un filamento di RNA marcato e si abbassa la temperatura fino a che si ricostituiscono le doppie eliche; la maggior parte saranno di DNA, ma alcune saranno ibride DNA/RNA. Studiando le doppie eliche ibride tra DNA ed RNA trascritto, si è verificato che per ogni gene solo uno dei 2 filamenti di DNA è in grado di formare la doppia elica ibrida con l’RNA trascritto; quindi solo uno dei 2 filamenti è complementare a un RNA trascritto; quindi solo uno dei 2 filamento ha funzionato da stampo per la trascrizione. Ma in regioni diverse dello stesso cromosoma, per altri geni, può essere l’altro filamento a fungere da stampo (schema in basso a destra, nella diapositiva). RNA trascritti H DNA C N H O Ibrido RNA-DNA Ibrido RNA-DNA Filamenti di RNA non ibridato Uracile Timina

12 La Trascrizione RNA promotore terminazione Tipo abbondanza coeff. sed.
C-G G-C RNA TGTTGACA TATAAT -35 -10 11-15 nucl 5-8 nucl Sito di inizio promotore terminazione Sito di attacco dell’aminoacido Tipo abbondanza coeff. sed. La trascrizione inizia e finisce in punti precisi del DNA e procede sempre aggiungendo nuovi ribo- nucleotidi liberi (nucleotidi per l’RNA) all’estremità in cui è presente il carbonio 3 dell’ultimo ribo-nucleotide che fa parte del nascente filamento di RNA; il filamento di RNA si allunga in direzione 3’ esattamente come i nuovi filamenti di DNA durante la replicazione (vedere diapositiva 12); il sito di inizio della trascrizione del filamento di DNA da trascrivere è preceduto, nella propria direzione 3’, da una particolare regione in cui particolari sequenza, molto precise e costanti che indirizzano il posizionamento corretto dell’enzima responsabile della trascrizione, l’RNA polimerasi (in alto, nella diapositiva) sono intervallate da sequenze variabili; questa regione si chiama promotore. La fine della trascrizione avviene in un’altra regione, all’estremità 5’ del filamento di DNA che viene trascritto; si tratta di brevi sequenze G-C, in cui molecole di guanina e citosina sono regolarmente; così l’RNA trascritto ha, in corrispondenza, sequenze C-G, in modo che lo stesso filamento polinucleotidico possa ripiegarsi e avvolgersi a doppia elica su se stesso (doppia elica “a forcina”: in alto a destra nella diapositiva). Riepilogando l’RNA polimerasi si posiziona all’altezza del promotore, comincia a scorrere lungo il filamento polinucleotidico del DNA da trascrivere in direzione 5’, qualche nucleotide a valle del promotore comincia a sintetizzare il filamento di RNA, aggiungendo progressivamente i ribo-nucleotidi complementari ai (desossiribo-)nucleotidi del DNA, giunto al sito di terminazione interrompe la trascrizione e si stacca dal filamento di DNA (schema in mezzo nella diapositiva). Ci sono molte diverse famiglie di RNA; le principali sono (vedere la tabella in basso a destra nella diapositiva): 1. l’RNA ribosomiale (rRNA), che garantisce l’impalcatura funzionale dei ribosomi; i ribosomi sono gli organelli cellulari in cui avviene la sintesi delle proteine; ci sono 3 principali classi di rRNA, che differiscono per il peso; il peso è misurato con l’ultracentrifuga (vedere diapositiva 10) e si utilizza il coefficiente di sedimentazione, “S” come unità di misura; allora, per esempio, le 3 classi di rRNA di Escheirichia coli vengono indicate con 23S, 16S e 5S; 2. l’RNA messaggero, che contiene l’informazione per la sintesi delle proteine; ad ogni RNA messaggero corrisponde, in generale, una specifica catena polipeptidica; quindi c’è un numero elevatissimo di diversi mRNA (migliaia o decine di migliaia, a seconda degli organismi), con peso molto diverso fra loro; 3. l’RNA di trasferimento (tRNA), che svolge un ruolo cruciale nella “traduzione” del linguaggio dei nucleotidi, presenti nel DNA e nell’RNA messaggero nel linguaggio degli aminoacidi, presenti nelle proteine; le molecole di tRNA hanno una forma a trifoglio, con 3 forcine (vedi sopra); al centro della forcina centrale (vedere lo schema in basso a sinistra) c’è l’anticodone, cioè una breve sequenza che riconosce le unità di codice presenti sull’RNA messaggero; all’estremità della molecola, in corrispondenza del “gambo”, c’è il sito in cui si lega un aminoacido: ogni tipo di tRNA ha un suo specifico anticodone e si lega a un unico specifico aminoacido, cioè ad ogni anticodone corrisponde uno e un solo aminoacido. rRNA 80% 23S, 18S, 5S tRNA 15% 4S mRNA 5% vario anticodone

13 Natura molecolare delle mutazioni geniche
Delezione di base Sostituzione di base TAG T AG TAG AG TAG transizione TAG TAG T TAG TAG A G Inserzione di base T C CODICE GENETICO Conoscendo la natura chimica e l’organizzazione molecolare dei geni, si possono definire meglio la natura molecolare e i meccanismi di origine delle mutazioni geniche, anche allo scopo di capire il codice genetico. Alcune mutazioni riguardano la perdita o l’aggiunta di numerosi nucleotidi rispetto alla sequenza standard; tuttavia le mutazioni più diffuse e più semplici riguardano singole basi: o sostituzione di singole basi o inserimento – rimozione di singole basi. Per quanto riguarda la sostituzione di base (vedere lo schema a sinistra), si chiama transizione la sostituzione di una base con una base dello stesso tipo (purina con purina, pirimidina con pirimidina), trasversione la sostituzione di una base con una base del tipo opposto (purina con pirimidina, pirimidina con purina). Quando si perde una base si parla di delezione di base, per distinguerla dalle delezioni più grandi; quando si inserisce si parla di inserzione (esempi animati in alto a destra). Per capire l’impatto delle modificazioni di singole basi sui prodotti dei geni, occorre un breve cenno sul codice genetico, di cui si tratterà ampiamente di seguito (diapositive 16-18). Per codificare in modo univoco sequenze polipeptidiche, in cui in ogni posizione possono trovarsi 20 aminoacidi diversi, occorre che vi siano almeno 20 unità di codice diverse fra loro nel DNA; le singole basi, che sono 4, sono insufficienti; sequenze di 2 basi (doppiette) in tutte le combinazioni possibili, che sono 16, sono insufficienti; sequenze di 3 basi (triplette) in tutte le combinazioni possibili, che sono 64, sono più che sufficienti. Per capire l’effetto delle singole sostituzioni di base o delle singole inserzioni o delezioni di base, occorre capire le modalità di lettura del codice; innanzi tutto occorre verificare se effettivamente il codice è a triplette; poi bisogna verificare se le triplette si sovrappongono tra loro (lettura per sovrapposizione) o no (lettura per giustapposizione): in quest’ultimo caso ogni base appartiene a una sola tripletta: nell’esempio in basso a destra la 1° tripletta è TAG, la 2° tripletta è TAG, la 3° tripletta è TAG; se la lettura è per giustapposizione, le basi possono appartenere fino a 3 triplette consecutive: nell’esempio in basso a destra la 1° tripletta è TAG, la 2° tripletta è AGT, la 3° tripletta è GTA e la 3° base della prima tripletta (G) è anche la 2° base della 2° tripletta e la 1° base della 3° tripletta. La natura e le modalità di lettura del codice genetico verranno affrontate di seguito. trasversione Per codificare 20 aminoacidi, non bastano 4 nucleotidi e nemmeno 16 coppie di nucleotidi; sono necessarie combinazioni di almeno 3 nucleotidi (triplette) che sono 64 purina pirimidina 1 2 3 tripletta Lettura per giustapposizione TAG Lettura per sovrapposizione 1 2 3 tripletta

14 Natura del codice genetico
Se la lettura del codice fosse stata per sovrapposizione, una singola sostituzione di base avrebbe comportato la modificazione di tanti aminoacidi quante sono le basi che fanno parte dell’unità codificante (nell’esempio presente, supponendo un codice a triplette, gli aminoacidi modificati da una singola sostituzione di base avrebbero dovuto essere 3); invece si osserva la modificazione di un solo aminoacido; pertanto la lettura del codice è per giustapposizione. 1 2 3 tripletta TA C G TAG TAG TAG TAG 1 2 3 tripletta proflavina proflavina rII+ rII + - rII+ rII rII+ rII rII+ soppressore FCO 2 mutazioni successive di segno opposto (inserzione + delezione), separabili per crossing over, ripristinano la corretta cornice di lettura; quindi il codice è letto senza interruzioni e le sfasature dovute alla prima mutazione si mantengono a valle di essa fino a che non sono neutralizzate dalla seconda proflavina proflavina proflavina rII+ Sono noti molti esempi di singole mutazioni geniche il cui risultato è la sostituzione di un singolo aminoacido con un altro, e non di una serie di più aminoacidi consecutivi con un’altra: dunque la lettura delle unità codificanti (triplette di nucleotidi ?) non è sovrapposta: ciascun nucleotide fa parte di una sola unità di codice (schema in alto nella diapositiva). Le delezioni e le inserzioni di base invece sono mutazioni catastrofiche: la catena polipeptidica è costituita, a valle del sito di inserzione/delezione, di una serie completamente diversa di aminoacidi; c’è uno sfalsamento della “cornice di lettura” delle unità di codice che si trasmette da un’unità a quella successiva con un effetto domino; quindi non c’è nessun intervallo, all’interno di un gene, fra le unità di codice, che possa “assorbire” l’effetto dello sfalsamento: quindi le unità di codice sono giustapposte (schema al centro, a sinistra). Queste mutazioni sono state studiate nella regione rII del fago T4; se per ricombinazione intragenica si trovano 2 mutazioni di segno opposto (un’inserzione + una delezione di base), a valle della seconda mutazione si ripristina la sequenza originario di aminoacidi e ricompare il fenotipo selvatico: la seconda mutazione, provocando uno sfalsamento di segno contrario rispetto alla prima, ripristina, a valle, la corretta cornice di lettura (schema in centro e in basso, a destra); ovviamente perché la proteina sia funzionale occorre che il tratto compreso tra le 2 mutazioni, in cui c’è lo sfalsamento delle unità di codice, quindi gli aminoacidi sono diversi rispetto al prodotto del gene normale, sia molto piccolo. La proflavina è una sostanza che con molta efficienza induce inserzioni o delezioni di basi; studiando i risultati di trattamenti multipli e successivi di proflavina, analizzando sempre la regione rII, si è verificato che se su un gene sono presenti 3 mutazioni dello stesso segno (3 delezioni o 3 inserzioni), a valle della 3° mutazione si ripristina, a valle, la corretta cornice di lettura (schema in basso, a sinistra); questa è la verifica decisiva che il codice genetico è effettivamente a triplette: ci vuole una tripletta di nucleotidi (cioè una sequenza di 3 nucleotidi consecutivi) per codificare un aminoacido. rII rII rII+ 3 mutazioni successive dello stesso segno, separabili per crossing over (3 inserzioni o 3 delezioni) ripristinano la corretta cornice di lettura; le sfasature dovute alla prima mutazione si mantengono a valle di essa fino a che non sono neutralizzate dalla seconda e dalla terza; quindi il codice è a triplette TAG TG TA AG TAG TAG TAG TTAG TAG AG TAG

15 Decifrazione del codice genetico
Costruendo un mRNA in vitro costituito di un unico nucleotide (X), ci sarà una sola tripletta (XXX); effettuando la sintesi proteica in vitro, si formerà un polipeptide costituito da un unico aminoacido (Z-Z-Z-…), codificato dalla tripletta XXX UUU UUU UUU Phe Phe Phe Costruendo un mRNA in vitro costituito di una miscela di nucleotidi (X e Y) in proporzioni note (p e q), ci sarà una miscela di triplette in proporzioni prevedibili (p3 XXX; p2q XXY, XYX, YXX; pq2 XYY, YXY, YYX; q3 YYY); effettuando la sintesi proteica in vitro, si formerà un polipeptide costituito da una miscela di aminoacidi nelle stesse proporzioni delle triplette che li codificano UUU 27/64 UUG, UGU, GUU 9/64 UGG, GUG, GGU 3/64 GGG 1/64 Phe 27/64 Val 12/64 Leu, Cys 9/64 Gly 4/64 Trp 3/64 U:G = 3:1 La scoperta che l’unità codificante era effettivamente una tripletta ha rapidamente messo in moto le ricerche mirate alla decifrazione del codice genetico, cioè all’identificazione delle corrispondenze fra triplette di nucleotidi e aminoacidi. Per decifrare il codice genetico, agli inizi degli anni ‘60, Nirenberg e Mathaei, usarono mRNA artificiali, in combinazioni note di nucleotidi, sintetizzati a caso, facendo effettuare la sintesi delle corrispondenti catene polipeptidiche in estratti di Escheirichia coli privi di DNA e mRNA. Usando un solo nucleotide (il primo fu il poli-U, una sequenza costituita dal solo uracile), il risultato, come atteso fu un polipeptide costituito dalla ripetizione di un solo aminoacido (il poli-U codifica per un polipeptide costituito dalla ripetizione di molte copie dell’aminoacido fenilalanina); usando proporzioni note di 2, 3 o 4 nucleotidi e studiando la composizione dei polipeptidi risultanti, si sono assegnati numerosi aminoacidi a specifiche triplette. Raffinando le tecniche di sintesi di mRNA artificiali (mini RNA costituiti di una sola tripletta, o RNA costituiti dalla precisa ripetizione della stessa tripletta) alla metà degli anni ’60 il codice genetico fu completamente decifrato. Poiché il codice genetico fu decifrato a partire dall’mRNA, le unità di codice sono espresse come triplette di mRNA; a queste triplette fu dato il nome di codoni; il primo nucleotide del codone è quello più vicino all’estremità 5’ dell’mRNA, mentre il terzo ed ultimo è quello più vicino all’estremità 3’. Usando mini mRNA (1 sola tripletta), capaci di determinare il legame tra il tRNA complementare e il suo aminoacido consentendone l’identificazione, e mRNA costituiti da copolimeri ripetitivi della stessa tripletta (XYW)n, si è completamente decifrato il codice genetico

16 I codoni I codoni sono le triplette di basi di mRNA che codificano per specifici aminoacidi; sono complementari e antiparallele sia alle corrispondenti triplette sul DNA del gene trascritto, sia a quelle degli anticodoni, presenti sul tRNA corrispondente; la prima base è all’estremità 5’, l’ultima all’estremità 3’ UUU Phe UUC Phe UUA Leu UUG Leu UCU Ser UCC Ser UCA Ser UCG Ser UAU Tyr UAC Tyr UAA STOP UAG STOP UGU Cys UGC Cys UGA STOP UGG Trp CUU Leu CUC Leu CUA Leu CUG Leu CCU Pro CCC Pro CCA Pro CCG Pro CAU His CAC His CAA Gln CAG Gln CGU Arg CGC Arg CGA Arg CGG Arg AUU Ile AUC Ile AUA Ile AUG Met ACU Thr ACC Thr ACA Thr ACG Thr AAU Asn AAC Asn AAA Lys AAG Lys AGU Ser AGC Ser AGA Arg AGG Arg GUU Val GUC Val GUA Val GUG Val GCU Ala GCC Ala GCA Ala GCG Ala GAU Asp GAC Asp GAA Glu GAG Glu GGU Gly GGC Gly GGA Gly GGG Gly La tabella presentata nella diapositiva presenta la decifrazione completa del codice genetico. A 61 codoni su 64 dell’mRNA corrispondono specifici aminoacidi; a ciascuno di questi 61 codoni corrisponde uno ed un solo aminoacido; questo significa che il codice genetico non è ambiguo, che data una sequenza di codoni, ne risulta una e una sola catena polipeptidica. Nella tabella gli aminoacidi sono rappresentati dalle loro sigle (p. es. Ala=alanina, Pro=prolina etc.). Tuttavia la maggioranza degli aminoacidi è codificata da più di un codone: la serina (Ser), la leucina (Leu) e l’arginina (Arg) sono codificatela ben 6 codoni ciascuna; questo significa che il codice è degenerato, che data una catena polipeptidica, questa può risultare da più di una sequenza di codoni. Infine il codice genetico è (quasi) universale: agli stessi codoni corrispondono gli stessi aminoacidi in (quasi) tutti i viventi e le eccezioni sono minime. Il codice genetico non è ambiguo: ogni codone codifica per un solo aminoacido Il codice genetico è degenerato: molti aminoacidi sono codificati da più di un codone Il codice genetico è universale: quasi tutti i viventi condividono lo stesso codice genetico

17 1) Usati come mini mRNA non legano alcun aminoacil-tRNA
Anticodoni e tRNA Ogni specie di tRNA ha un anticodone specifico e lega un solo aminoacido DEGENERAZIONE DEL CODICE CODONI NON SENSO 1) Alcuni aminoacidi si legano a più di un tRNA UAA, UAG, UGA 2) Alcune basi all’estremità 5’ dell’anticodone (corrispondenti all’ultima base, in 3’, del codone) presentano un appaiamento non stringente (vacillamento) che riconosce più di una base in 3’ del codone; quindi alcuni tRNA riconoscono più di un codone 1) Usati come mini mRNA non legano alcun aminoacil-tRNA 2) Prodotti in seguito a una singola sostituzione di base a partire da triplette molto simili, producono, in corrispondenza della loro posizione, un’interruzione della catena polipeptidica (mutazioni non senso) al 5’ dell’anticodone al 3’ del codone G U, C C A U A, G I U, C, A Il codice genetico è degenerato poiché spesso un aminoacido è codificato da più triplette; infatti, mentre ogni tRNA ha un solo anticodone specifico e lega un solo aminoacido, alcuni aminoacidi possono legarsi a più di un tRNA; per di più il nucleotide al 5’ dell’anticodone, a causa della curvatura della molecola del tRNA, si può appaiare con meno forza al nucleotide al 3’ del codone, quindi può appaiarsi con nucleotidi diversi, appartenenti a codoni diversi; quel tRNA può “riconoscere” più di un codone. Non esistono tRNA con anticodoni per le triplette “non senso”; in corrispondenza di queste triplette, quindi, si interrompe la traduzione e finisce la catena polipeptidica. Una mutazione che trasformi una tripletta traducibile in una tripletta non senso è una mutazione “non senso”. L’effetto delle mutazioni non senso possono essere neutralizzati da una mutazione nel gene che codifica il tRNA in corrispondenza dell’anticodone, in seguito alla quale il tRNA “riconosca” una tripletta non senso e collochi il proprio aminoacido nella catena polipeptidica in corrispondenza del codone non senso, evitando così l’interruzione della traduzione. 3) Le mutazioni non senso possono essere neutralizzate da mutazioni soppressori esterne al gene: si tratta di mutazioni nell’anticodone di un tRNA (p.es. GUA -> UUA, anticodone di UAA) I codoni non senso sono detti di terminazione perché interrompono la sintesi di una catena polipeptidica

18 Sintesi proteica e traduzione
Il sito di inizio della traduzione nell’mRNA è una tripletta AUG, GUG preceduta di poco da sequenze complementari all’rRNA 16 S; tale tripletta codifica per N-formil-metionina (in E. coli) 23 S 50 S Sito P Sito A 30 S 16 S il tRNA con l’anticodone complementare al codone esposto nel sito A vi si lega, essendo già associato al proprio aminoacido (aminoacil-tRNA) Negli eucarioti l’RNA prima di entrare nel citoplasma subisce una maturazione: al 5’ viene aggiunta una 7-metilguanosina, al 3’ una catena di poli-A aa1 aa2 aa1 aa1 aa2 aa3 Sul sito P è presente un tRNA entrato in precedente, cui è legato il nascente polipeptide (peptidil-tRNA);il polipeptide si stacca dal tRNA sul sito P e si lega all’aminoacido legato al tRNA sul sito A AAAA La sede in cui avviene la sintesi proteica, cioè la traduzione della sequenza di codoni (triplette di nucleotidi) dell’mRNA in sequenza di aminoacidi della nascente catena polipeptidica è costituita dai ribosomi. I ribosomi sono costituititi dallrRNA e da molte proteine: sono organizzati in 2 subunità di peso diverso: subunità maggiore e minore. Nello schema in alto a sinistra è descritta la collocazione degli rRNA nelle 2 subunità del ribosoma. Da un punto di vista funzionale il ribosoma ha 2 siti, al confine fra le 2 subunità: il sito A, degli aminoacidi, e il sito P, dei polipeptidi (schema in alto, al centro). L’animazione al centro descrive la sequenza dei processi della sintesi proteica: 1. giunge sul ribosoma l’estremità 5’ dell’mRNA da tradurre con il 1° codone sul sito A; 2. sul sito A, in corrispondenza del 1° codone, si colloca il tRNA con l’anticodone complementare, legato al suo aminoacido specifico (aa1); il complesso tRNA+aminoacido si chiama aminoacil-tRNA; 3. l’mRNA slitta di un codone: il 1° codone ora si trova nel sito P, mentre il 2° ritrova sul sito A; 4. l’aminoacil-tRNA con il 1° anticodone e l’aminoacido aa1 si sposta sul sito P, mentre sul sito A si posa l’aminoacil-tRNA (con il 2° anticodone) che porta l’aminoacido aa2; 5. l’aminoacido aa1 si stacca dal tRNA sul sito P e si lega, mediante un legame peptidico (vedere diapositiva 2), all’aminoacido aa2 che si trova, legato al proprio tRNA, in corrispondenza del sito A; a quest’ultimo tRNA non è più legato un singolo aminoacido, ma un piccolo polipeptide (un dipeptide); in queste condizioni viene chiamato peptidil-tRNA; 6. il tRNA nel sito P, privo di legami con il proprio aminoacido, si allontana; 7. l’mRNA slitta di un codone: il 2° codone ora si trova nel sito P, mentre il 3° ritrova sul sito A; 8. il peptidill-tRNA con il 2° anticodone e il dipeptide aa1-aa2 si sposta sul sito P, mentre sul sito A si posa l’aminoacil-tRNA (con il 3° anticodone) che porta l’aminoacido aa3; 9. il dipeptide aa1-aa2 si stacca dal tRNA sul sito P e si lega, mediante un legame peptidico, all’aminoacido aa3 che si trova, legato al proprio tRNA, in corrispondenza del sito A; 10. il tRNA nel sito P, privo di legami con il proprio dipeptide, si allontana; 11. si procede così con l’allungamento, aminoacido per aminoacido, della catena polipeptidica, finchè giunge sul sito A uno dei 3 codoni STOP (vedere anche diapositiva 18), cui non corrisponde nessun anticodone e, quindi, nessun aminoacil-tRNA; 12. a questo punto sul sito A arriva, al posto di un aminoacil-tRNA, arriva un fattore di rilascio, che blocca la traduzione; il polipeptide sintetizzato fino a quel momento si stacca dall’ultimo tRNA, anche quest’ultimo si allontana dal ribosoma; 13. si allontana anche l’mRNA e il ribosoma è di nuovo disponibile per accogliere un altro mRNA e iniziare la sintesi di un nuovo polipeptide. I codoni STOP sono chiamati anche codoni non senso, poiché ad essi non corrisponde alcun anticodone ed alcun tRNA; vengono chiamati anche codoni di terminazione perché inducono la fine del processo di traduzione e il rilascio del polipeptide neosintetizzato. Il tRNA libero sul sito P si allontana, il codone e il peptidil-tRNA sul sito A si spostano sul sito P Non tutto l’mRNA viene tradotto: una parte, corrispondente agli introni dei geni, viene staccato e rimosso; l’altra parte, corrispondente agli esoni dei geni, viene saldata e tradotta Quando sul sito A giunge un codone di terminazione, al posto di un tRNA vi si lega un Fattore di Rilascio che impedisce l’allungamento del poipeptide e conclude il processo