L'interfase è il periodo tra successive mitosi e consiste in tre fasi: G1, S, e G2. Durante la fase S (sintesi), le molecole di DNA di ogni cromosoma vengono.

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1 L'interfase è il periodo tra successive mitosi e consiste in tre fasi: G1, S, e G2. Durante la fase S (sintesi), le molecole di DNA di ogni cromosoma vengono replicate producendo un identico paio di molecole di DNA chiamate cromatidi (talvolta cromatidi "fratelli"). Ogni cromosoma replicato quindi entro in mitosi con due molecole identiche di DNA. Sottili filamenti di cromatina appaiono comunemente come materiale granulare amorfo nel nucleo colorato di cellule in interfase.

2 Prima e dopo la fase S vi sono due periodi di intensa attività metabolica, crescita e differenziamento, detti G1 (gap = intervallo 1) G2 (gap 2). Durante la fase G1 le cellule si preparano per la sintesi di DNA (fase S) e durante la G2 hanno luogo la crescita e l'espansione cellulare. Le cellule possono uscire dal ciclo cellulare in fase G1 ed entrare in uno stato di riposo, o G0. Le cellule in G0 non proliferano ma sono vitali e metabolicamente attive, e possono rientrare nel ciclo attraverso la fase G1. Una volta in G1 la cellula è obbligata a completare il ciclo.

3 La fase M, o mitosi, comprende quattro tappe principali considerate in dettaglio più avanti: profase, metafase, anafase e telofase. La mitosi è di solito la fase più breve del ciclo cellulare, occupando 1 h del tempo totale di h richiesto per il ciclo completo in una cellula animale ideale. Il tempo trascorso in ogni fase della mitosi varia notevolmente. La profase richiede molto più tempo delle altre; la metafase è la più breve.

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5 Cyclin/cdk complexes are required at specific cell cycle transitions

6 M-phase promoting factor (MPF) inizia:
G1 cyclins segnalano alla cellula di preparare i cromosomi per la replicazione S-phase promoting factor (SPF) preparano la cellula a entrare in fase S e duplicare il DNA * durante la sintesi di DNA la ciclina E si degrada e compaiono le cicline di fase M (mitotiche) M-phase promoting factor (MPF) inizia: - L’assemblaggio del fuso mitotico - Dissolvimento dell’involucro nucleare - Condensazionedei cromosomi Inizia la metafase A questo punto MPF attiva il copmesso APC (Anaphase Promoting Complex)che permette: E A B 1) la separazione dei cromatidi fratelli e la migrazione ai poli 2) la degradazione delle cicline mitotiche (M-phase) 3) avvia la sintesi delle cicline della fase G1per il ciclo successivo 4) degradazione della geminina, una proteina che blocca la replicazione pre-mitotica del DNA sintetizzato in fase S. ,

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9 Control of Cell Cycle The cell cycle has checkpoints where feedback information from the cell can trigger the next phase Proteins are responsible for the control through bonding to signal receptors. 3 checkpoints: G1 checkpoint- makes the decision as to whether the cell will divide. If conditions are favorable. Like the cell is healthy and large enough proteins will stimulate the cell to start the S Phase. The cell cycle can also be stopped or sent to a resting point, Ex. Muscle and nerve cells, at this checkpoint.

10 G2 checkpoint- DNA replication is checked hear by DNA repair enzymes
G2 checkpoint- DNA replication is checked hear by DNA repair enzymes. If the DNA is copied correctly with no errors proteins then signal mitosis phase. Mitosis Checkpoint- Triggers the exit from mitosis phase.

11 G1 Checkpoint • Cell Cycle Arrest • DNA Repair

12 G1 Checkpoint • Apoptosis

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14 Danno prima dell’entrata in S
G1/S checkpoint Mediato dalle chinasi Chk1 e Chk2 Arresto rapido della replicazione, dovuto alla degradazione della fosfatasi Cdc25A la cui normale funzione e di defosforilare e così attivare la chinasi Cdk2 del complesso SMP, che a sua volta attiva la proteina Cdc45, che è essenaziale per l’assemblaggio del complesso di replicazione sull’origine di replicazione del DNA Rapido e transiente Mantenimento prolungato

15 Il gene p53 Poco più del 50% dei tumori umani presenta mutazioni di questo gene. Nella maggior parte dei casi, le mutazioni inattivanti che colpiscono entrambi gli alleli p53 sono acquisite dalla cellula somatica. Meno frequentemente alcuni soggetti ereditano un allele p53 mutato (sindrome Li-Fraumeni) e possono sviluppare numerosi tipi di neoplasie quali: Sarcomi; Carcinomi della mammella; Leucemie; Tumori cerebrali; Carcinomi della corticale del surrene. Rispetto alle forme sporadiche, le forme ereditarie si presentano in soggetti più giovani. La proteina p53 è localizzata nel nucleo ed entra in gioco come freno d’emergenza quando il DNA è danneggiato da radiazioni ionizzanti, raggi UV o sostanze chimiche.

16 Attivazione di p53 in risposta al danno del DNA
IR,UV, MMC.etposide,ROS p21 p53, inattivo e stabile Geni target on Puma, Bax Rilasco del citocromo c apoptosi

17 p53 si lega al DNA e stimola la trascrizione di alcuni geni che mediano due funzioni fondamentali: l’arresto del ciclo cellulare e l’apoptosi.

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19 Sono stati identificati studiando malattie rare come il retinoblastoma, che colpisce 1 bambino su 40% = casi familiari con trasmissione autosomica dominante, tumori multipli si sviluppano nella retina di entrambi gli occhi nella prima settimana dalla nascita. 60% = casi sporadici, un singolo tumore si sviluppa in un occhio nella prima infanzia. Affinché il retinoblastoma si sviluppi è necessario che entrambi gli alleli siano inattivi.

20 Prodotti proteici degli oncosoppressori.
Molecole che regolano la trascrizione nucleare ed il ciclo cellulare. Il gene Rb Rb è stato il primo gene oncosoppressore scoperto. Il suo prodotto è una fosfoproteina nucleare, pRb, che nel suo stato attivo (IPOfosforilato) costituisce un freno al passaggio dalla fase G1 alla fase S del ciclo cellulare.

21 La forma attiva di pRb complessata ai fattori di trascrizione E2F si lega al DNA ed inibisce la trascrizione dei geni i cui prodotti sono necessari alla fase S del ciclo cellulare. Quando i complessi ciclina D/CDK4,6 e ciclina E/CDK2 la inattivano IPERfosforilandola, rilascia i fattori E2F. I fattori E2F formano eterodimeri con la famiglia di proteine DP ed attivano la trascrizione di diversi geni bersaglio Quindi, se la proteina pRb è assente o alterata da mutazioni, la cellula progredisce verso la fase S senza alcun freno.

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23 REGOLAZIONE DEL CICLO CELLULARE
DA PARTE DEI NUTRIENTI

24 Vitamina A

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26 Nuclear Hormone Receptor Superfamily
AF1 LBD - AF2 DBD Helix 12 A/B C D E/F Nuclear Hormone Receptor Superfamily Type I family Type II family Steroid family Non-steroid family GR TR a, b PR RAR a, b, g AR VDR RXR a, b, g MR PPAR a, g, d ER a, b CAR, SXR/PXR LXR a, b, FXR

27 Conserved domains of transcription factors in nuclear-hormone
receptor superfamily A/B C E AF-2 domain Two non-repeating C4 Zn finger motif AF-1 domain Fig Lodish et al. Molecular Cell Biology

28 Retinoid X Receptor (RXR)
E’ espresso in tutte le cellule Regola numerosi processi eterodimerizzando con altri recettori nucleari (PPAR, VDR, LXR, FXR…….) Il suo ligando naturale e’ l’acido 9 cis retinoico, …..altri ?

29 Diverse Structure of Ligands for Nuclear Receptors

30 Ligand Induces a Conformational Change in
the LBD that Repositions helix 12 No Ligand Agonist

31 NR Antagonists Alter the Position of Helix 12
No Ligand

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33 Consensus sequences of DNA response elements for different
nuclear hormone receptors The glucocorticoid receptor and oestrogen receptor bind to their respective response elements as homodimers. The response element is an inverted repeat The vitamin D receptor, the thyroid hormone receptor and the retinoic acid receptor bind to their respective response elements as heterodimers (with RXR). The response element is an direct repeat. The spacing between these repeats determines the specificity of the interaction. Fig Lodish et al. Molecular Cell Biology

34 RAR A B C D E F A/B dominio di transattivazione INDIPENDENTE dal ligando C dominio che lega il DNA D cerniera E dominio che lega il ligando e dimerizzazione F funzione non conosciuta

35 RARE RAR-RXR AGGTCAnnnnnAGGTCA (DR5) RXR-RXR AGGTCAnAGGTCA (DR1) RXRE

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37 Nuclear Hormone Receptor- Ligand Complex Action 2
Recruitment of Coactivators is Necessary They are an Obligate ‘Bridge’ to Pol II complex* DNA Response Element TATA Box RNA polymerase II or pol II complex actually transcribes, starting at TATA box DNA site NH – receptor Ligand Bound L * Receptor-ligand can bind DNA and NOT recruit pol II = Antagonist

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39 In tumori sensibili l’acido retinoico causa un arresto della
crescita cellulare cellule normali tumori sensibili t. resistenti Trattamento con a.retinoico Trasfezione Con crescita crescita crescita RARb inibita inibita inibita

40 RARb ha 2 sottotipi: RARb2 e RARb4
RARb2 funziona come un gene soppressore di tumore RARb4 come un dominante negativo Topi transgenici con poco RARb2 o con molto RARb4 sviluppano tumori. Quindi l’acido retinoico agisce come soppressore della crescita cellulare legandosi a RARb2, mentre elevati livelli di RARb4 sopprimono questo effetto (tumori resistenti all’acido retinoico)

41 RETINOIDI e NEUROBLASTOMA
Retinoidi inducono differenziamento in cellule nervose Nei neuroblastomi inducono apoptosi DNA Microarray hanno dimostrato l’induzione di geni Pro-apoptotici da parte di retinoidi

42 Confronto dei profili di espressione genica in due campioni cellulari diversi
Estrazione dell’mRNA dai 2 campioni di cellule che si vogliono confrontare (1) (2) Conversione in cDNA (6) Immagine a colori raffigurante il microarray Marcatura con 2 fluorocromi diversi (3) Eccitazione della fluorescenza tramite laser (4) (5) Riconoscimento tra i cDNA provenienti dai 2 campioni e quelli già presenti sul microarray

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44 L’Acido retinoico induce arresto della crescita cellulare oppure proliferazione a seconda del tipo cellulare (es. epidermide o epitelio tracheale). Topi privati di vitamina A sviluppano molti tumori specialmente da epitelio tracheale. Trattamento con acido retinoico le blocca in G1: Ac. Retinoico ciclinaD1 mRNA

45 Degradazione e arresto in G1
Acido retinoico Induzione dei geni Addetti alla Ubiquitinazione Ub Ub Ub Ub Ciclina D1 Ciclina D1 Degradazione e arresto in G1

46 EFFETTO ANTIPROLIFERATIVO DELL’ACIDO RETINOICO SU VARI TUMORI
Tumore ciclina repressa Trachea D1 Neuroblastoma D3 Mieloide (U937) A, B, D2, D3, E Epatoma D1

47 Vitamina D

48 Produzione della Vitamina D da UVB
UVB ( nm) converte 7-deidrocolesterolo in pre-vitamina D Previtamina D3 subisce una isomerizzazione che risulta nella formazione della vitamina D3 (25 idrossivitamina D (25(OH)D)) Questa e’ convertita in 1,25-diidrossivitamina D3 (1,25(OH)2D3) nel fegato e nei reni

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50 Nuclear Hormone Receptor Superfamily
AF1 LBD - AF2 DBD Helix 12 A/B C D E/F Nuclear Hormone Receptor Superfamily Type I family Type II family Steroid family Non-steroid family GR TR a, b PR RAR a, b, g AR VDR RXR a, b, g MR PPAR a, g, d ER a, b CAR, SXR/PXR LXR a, b, FXR

51 Diverse Structure of Ligands for Nuclear Receptors

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53 Consensus sequences of DNA response elements for different
nuclear hormone receptors The glucocorticoid receptor and oestrogen receptor bind to their respective response elements as homodimers. The response element is an inverted repeat The vitamin D receptor, the thyroid hormone receptor and the retinoic acid receptor bind to their respective response elements as heterodimers (with RXR). The response element is an direct repeat. The spacing between these repeats determines the specificity of the interaction. Fig Lodish et al. Molecular Cell Biology

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55 La vitamina D causa un arresto della proliferazione cellulare e differenziamento in
cheratinociti osteoblasti cellule ematopoietiche VDR e’ specialmente espresso nelle sopracitate cellule quando sono proliferanti

56 Crescita dopo trattamento con Vitamina D
Cellule di tumore prostatico Alva-31(linea cellulare) 50% 0% Arresto in G1

57 I livelli di vitamina D circolanti diminuiscono con l’eta’
La mortalita’ del tumore alla prostata aumenta con la diminuzione alla esposizione alla luce solare I livelli di vitamina D circolanti diminuiscono con l’eta’ Alti livelli di sintesi di melanina correlano con un aumento dell’incidenza di tumori alla prostata Crescita dopo trattamento con Vitamina D Alva-31(linea cellulare) Alva-31(linea cellulare) + VDR antisenso 0% %

58 La forma attiva di pRb complessata ai fattori di trascrizione E2F si lega al DNA ed inibisce la trascrizione dei geni i cui prodotti sono necessari alla fase S del ciclo cellulare. Quando i complessi ciclina D/CDK4,6 e ciclina E/CDK2 la inattivano IPERfosforilandola, rilascia i fattori E2F. I fattori E2F formano eterodimeri con la famiglia di proteine DP ed attivano la trascrizione di diversi geni bersaglio Quindi, se la proteina pRb è assente o alterata da mutazioni, la cellula progredisce verso la fase S senza alcun freno.

59 X Vitamina D Induzione di p21 Rilascio di citocromo C
Repressione di geni Antiapoptotici

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62 Promotore di p27 Gene Luciferasi

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66 Vitamina D p27 p27fosforilata (proteina: piu’ stabile meno stabile)
Arresto in G1

67 Paracalcitolo (analogo della vitamina D)
HL60 (linea leucemica) A concentrazione nanomolare riduce le cellule in fase S Aumenta le cellule in fase G1 Ha effetto pro-differenziante Aumenta il numero di cellule che vanno incontro ad apoptosi

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69 Trattamento con Vit D3 aumenta l’espressione della Tuberina
(gene Oncosoppressore) or Vit D3

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72 Attivita’ del promotore di

73 TGF-b e Vit D3 aumentano l’espressione della Tuberina, di p21 e diminuiscono la ciclina A

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78 p53 p21 Retinoblastoma Varie caspasi Cellule ERa+
Il trattamento con vitamina D induce i geni per: Molecole di adesione p53 p21 Retinoblastoma Varie caspasi TGFb e il gene per il retinoblastoma sono indotti in tutti e due i tipi cellulari

79 Lo svantaggio maggiore per un suo impiego come farmaco antitumorale e’ la sua enorme influenza sul metabolismo del calcio e dell’osso.