CORSO di ORGANISMI TRANSGENICI

Presentazione sul tema: "CORSO di ORGANISMI TRANSGENICI"— Transcript della presentazione:

1 CORSO di ORGANISMI TRANSGENICI
Sara Caldarola Lab (studio 4317 Prof Loreni) ORARIO di RICEVIMENTO: Mercoledi 11:00-12:00

2 ANIMALI TRANSGENICI : Metodologie e Applicazioni
DROSOPHILA TRANSGENICA PIANTE TRANSGENICHE: Metodologie e Applicazioni OGM AGRICOLO ALIMENTARI

3 G 19/03: PRESENTAZIONE + Lez1 ANIMALI TRANSGENICI
G 26/03: OGM (Prof. Gravina)Lez1 G 02/04: OGM (Prof. Gravina)Lez2 G 09/04: Lez2 ANIMALI TRANSGENICI ***consegna articoli G 16/04: Lez3 ANIMALI TRANSGENICI G 23/04: Lez4 DROSOPHILA G 30/04: Lez5 PIANTE G 07/05: Lez6 PIANTE G 14/05: PRESENTAZIONI (3 a lezione) 15m G 21/05: PRESENTAZIONI G 28/05: PRESENTAZIONI G 04/06: PRESENTAZIONI

4 ANIMALI TRANSGENICI : definizione
Animali transgenici: animali ottenuti attraverso una manipolazione del genoma, inserendo uno o più geni, appartenenti alla stessa specie, o più spesso di specie diverse.

5 GFP ANIMALI TRANSGENICI : come si producono??? Vettori retrovirali
Microiniezione del DNA Cellule staminali embrionali Gene targeting/ gene trap KO condizionali Trasferimento del nucleo YAC GFP

6 VETTORI RETROVIRALI Permettono il trasferimento e l’integrazione
di materiale genetico nella cellula ospite

7 Vantaggi dei vettori non virali
Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni Riduzione del rischio di reazione immunitaria Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di trasdurre molecole di DNA anche molto grandi Possibilità di produzione in grandi quantità a basso costo Svantaggi dei vettori non virali Scarsa efficienza sia di trasduzione che di integrazione Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale Vantaggi dei vettori virali Alta efficienza di trasduzione Svantaggi dei vettori virali Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) Molecole di DNA di dimensioni limitate Reazioni immunitarie Costi elevati

8 Possibile effetto citopatico
VETTORI VIRALI Vettore virale Vantaggi Svantaggi Retrovirus Capacità d'inserimento del gene, integrazione stabile nel DNA dell'ospite, elevati titoli di virus ricombinante, ampio tropismo d'infettività, relativa facilità di manipolazione del genoma virale Difficoltà nel controllare l'infezione virale, mancata infezione delle cellule non in divisione, integrazione a caso nel genoma dell'ospite Lentivirus Infezione delle cellule in divisione o meno, espressione stabile del gene, elevata capacità d'inserimento Mutagenesi potenziale presenza di sequenze proteiche regolatrici e accessorie Adenovirus Elevati titoli di virus, alta espressione genica, grande capacità d'inserimento, infezione di cellule in divisione e non in divisione Risposte immuni alle proteine virali, nessuna integrazione nel genoma dell'ospite, espressione genica transitoria Virus adeno-associati Infettano le cellule in divisione o meno, ampio tropismo cellulare, potenziale d'integrazione, bassa immunogenicità e non patogenicità Limitate capacità per i transgeni, difficile generazione di alti titoli virali, presenza di adenoviruds o herpevirus per la moltiplicazione dei virus adeno-associati Herpesvirus Infettano un'ampia varietà di tipi cellulari, alta capacità d'inserzione, tropismo naturale per le cellule neuronali, seguita dalla produzione di alti titoli virali Possibile tossicità, rischio di ricombinazione, nessuna integrazione virale nel DNA dell'ospite Poxvirus Alta capacità d'inserzione, possibile inserzione di grandi framenti di DNA, alti livelli di di espressione transgenica,, seguita da virus vivo ricombinante Possibile effetto citopatico Virus di Epstein-Barr Infetta cellule in divisione o meno con prevalenza per i linfociti B, alta capacità d'inserimento Difficoltà di controllare le linee cellulari

9 Ciclo vitale di un retrovirus
• genoma a RNA, 2 copie • L’enzima trascrittasi inversa converte l’RNA in DNA a doppio filamento nel citoplasma della cellula infetta. • Il DNA lineare migra nel nucleo e viene integrato nel DNA della cellula ospite. Il DNA integrato è chiamato provirus. • L’apparato della cellula ospite trascrive il provirus producendo RNA virali che fungono sia da mRNA che da genomi che saranno impaccati nei nuovi virioni. • 2 copie di RNA genomico vengono incapsidate in ogni virione

10 DNA RNA

11 Struttura genomica ed espressione genica dei retrovirus
Il genoma tipico contiene 3 “geni” Gag (componenti del core nucleoproteico) Pol (replicazione e ricombinazione) Env (componente della membrana esterna)

12 Genoma retrovirale Vettore retrovirale Lunghezza massima: 8Kb
Trascrittasi inversa e integrasi Proteina strutturale capside Proteina per involucro Psi + non codificante. Per confezionamento nel capside Lunga sequenza terminale ripetuta Vettore retrovirale Inserito nelle cellule eucariotiche con bassissima efficienza tramite trasfezione/elettroporazione Con alta efficienza Mediante INFEZIONE Lunghezza massima: 8Kb

13 INFEZIONE DI CELLULE IN COLTURA
Le particelle virali prodotte sono difettive per la replicazione Possiedono un gene marcatore selezionabile (NeoR) Infettano facilmente cellule in attiva replicazione Si integrano stabilmente nel genoma ospite e producono il geneX INFEZIONE DI CELLULE IN COLTURA E PRODUZIONE GENE X

14 Packaging cell lines Linee cellulari transfettate stabilmente con geni virali codificanti per proteine strutturali del capside (late genes), necessarie per l’assemblaggio dei virioni. La loro transfezione transiente con il DNA-vettore determina l’impacchettamento del costrutto nel virione. Si ottiene in questo modo un vettore virale di transfezione completo.

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18 Utilizzo vettori retrovirali:
A) TERAPIA GENICA Tecnica terapeutica in cui un gene funzionale viene inserito nelle cellule somatiche di un paziente Scopo: • Correggere un difetto genetico • Fornire una nuova funzione alla cellula Applicabilità: 1. Malattie genetiche classiche (un solo gene coinvolto, ereditarietà mendeliana) 2. Malattie multigeniche (cancro) 3. Malattie genetiche acquisite (AIDS) 4. Malattie non genetiche 80% dei protocolli coinvolge malattie delle categorie 2-4

19 TERAPIA GENICA NELLE MALATTIE GENETICHE CLASSICHE
E’ importante stabilire se il processo citopatico risulta da: Loss of function del gene mutato, cioè la mutazione nel gene provoca perdita della funzione genica introduzione del gene normale OK Gain of function cioè la mutazione nel gene produce una proteina con funzioni diverse da quelle della proteina normale introduzione del gene normale INEFFICACE

20 Caratteristiche del vettore ideale per la TERAPIA GENICA
• Efficiente (trasdurre un numero di cellule elevato). • Dovrebbe garantire una prolungata produzione della proteina terapeutica (a livelli adeguati). • Capace di incorporare DNA di varie dimensioni. • Dovrebbe garantire la regolazione (trascrizionale, traduzionale o post-traduzionale) dell’espressione del gene terapeutico • Non dovrebbe essere patogeno. • Amministrabile direttamente nel paziente. • In grado di raggiungere specificamente le cellule bersaglio. • Ben tollerato. • Non dovrebbe avere componenti che inducono risposta immune. • Facile da produrre in maniera riproducibile. IL VETTORE IDEALE NON ESISTE. IL VETTORE PIU’ UTILIZZATO OGGI E’ IL VETTORE RETROVIRALE

21 Vettori Retrovirali: • Pro situazione attuale e prospettive future – efficiente trasduzione di cellule in attiva replicazione (linee tumorali) • linfociti e precursori delle linee ematopoietiche – notevole esperienza clinica ex vivo • Contro – integrazione random • attivazione di oncogeni • shut-off trascrizionale dipendente dal sito di integrazione – capacità di impaccamento limitate (max. 7 kb) - Incapacità di infettare cellule in quiescenza (cellule nervose)

22 TERAPIA GENICA IN VIVO Somministrazione diretta del gene terapeutico
in vivo alle cellule: • iniezione diretta (ad es. nel muscolo scheletrico distrofico) • somministrazione in prossimità del tessuto (ad es. vie respiratorie nella fibrosi cistica) Problemi: • Trasferimento quantitativamente limitato • Rischio di inserimento in cellule sane • Reazione immunitaria

23 TERAPIA GENICA EX VIVO IN VIVO EX VIVO
Trapianto di cellule geneticamente modificate: • Estrazione/preparazione delle cellule primarie o di linea • Trasferimento del gene in vitro • Reimpianto delle cellule Problemi: • Cellule autologhe ingegnerizzate: laboriosa, vita limitata • Cellule eterologhe ingegnerizzate: reperibilità, compatibilità

24 TERAPIA GENICA per deficit dell’ADA
ADA (adenosina deaminasi): enzima coinvolto nel salvataggio delle purine nel percorso di degradazione degli acidi nucleici, indispensabile in molti tipi cellulari. La sua carenza causa una patologia recessiva molto rara che ha effetti molto seri sui linfociti T, una delle principali classi di cellule del sistema immunitario: GRAVE E COMPLESSA IMMUNODEFICIENZA ADA e TERAPIA GENICA: Il gene ADA è piccolo e clonato nel 1990 Le cellule bersaglio sono i Linfociti T, cellule facilmente ottenibili dal paziente e facilmente coltivabili TERAPIA GENICA EX-VIVO Livello di espressione puo’ variare senza conseguenze (range &)

25 Trial clinico per deficit ADA (1990)

26 PROBLEMI DELLA TERAPIA GENICA
Stabilità d’espressione del transgene nel tempo 2. Mutagenesi inserzionale 3. Regolazione dell’espressione del transgene (promotori inducibili) 4. Cell targeting 5. Pericolosità, Etica

27 Utilizzo vettori retrovirali:
B) PRODUZIONE TOPI TRANSGENICI SVANTAGGI Max 8Kb L’animale puo’ risultare contaminato da retrovirus delle cellule helper

28 GFP ANIMALI TRANSGENICI : come si producono??? Vettori retrovirali
Microiniezione del DNA Cellule staminali embrionali Gene targeting/ gene trap KO condizionali Trasferimento del nucleo YAC GFP

29 2) MICROINIEZIONE del DNA
Gli organismi transgenici possono essere ottenuti modificando cellule embrionali totipotenti mediante iniziezione di materiale genetico

30 Stimolazione della ovulazione delle femmine donatrici (da 5 a 35)
Dopo accoppiamento gli ovuli fertilizzati sono microiniettati con DNA lineare contenente il transgene (circa 200 copie) all’interno del pronucleo maschile Gli ovuli microiniettati (25-40) vengono impiantati in una madre adotttiva resa pseudogravida da maschio vasectomizzato. Dopo 3 settimane progenie e analisi. Accoppiamento e analisi progenie per capire se integrazione è nella linea somatica o germinale

31 INIEZIONE DI DNA nel pronucleo maschile di un oocita appena fecondato
INIEZIONE DI DNA nel pronucleo maschile di un oocita appena fecondato. Più precisamente, si depositano con una microsiringa 1-2 picolitri di DNA (circa copie del gene da inserire). A monte del gene (cDNA) da trasferire nel pronucleo si utilizza una sequenza promotore che puo’ conferire al gene la specificità di espressione in un particolare tessuto

32 Il gene inserito viene integrato nel genoma della cellula uovo che viene trapiantata in una madre adottiva , che darà origine alla nascita di un topino “chimera” (mosaico di cellule con patrimoni genetici diversi). Nella fase successiva si effettua un incrocio riproduttivo tra il topino chimera e un topo normale con la nascita di topini con i nuovi geni ma eterozigotici; solo nell’incrocio successivo tra i precedenti avremo la nascita di topini omozigotici per il gene introdotto

33 ATG * Promotore Introne 1 Poly-A CDS Iniezione di costrutti di espressione lineari, che si integrano sotto forma di concatameri a partire dai primissimi stadi di sviluppo. Gli animali nati da questi esperimenti devono essere analizzati per mezzo di Southern blotting o PCR per valutare se il transgene si è integrato e in quante copie. Gli animali transgenici (founders e/o loro discendenza) vengono successivamente analizzatati per valutare se il transgene si esprime in, ed eventualmente gli effetti fenotipici della sua espressione

34 EFFICIENZA DELLA MICROINIEZIONE DEL DNA
Al max 5% degli ovuli inoculati genera prole transgenica!!!

35 Utilizzo microiniezione del DNA
ANIMALI COME BIOREATTORI

36 Utilizzo microiniezione del DNA
ANIMALI COME BIOREATTORI

37 SVANTAGGI Integrazione casuale del transgene Integrazione multipla copia (effetto tossico?) Bassa efficienza (50 animali transgenici/1000 uova inoculate) nonostante questo… E’ IL METODO PIU’ UTILIZZATO PER LA PRODUZIONE DI TOPI TRANSGENICI

38 GFP ANIMALI TRANSGENICI : come si producono??? Vettori retrovirali
Microiniezione del DNA Cellule staminali embrionali Gene targeting/ gene trap KO condizionali Trasferimento del nucleo YAC GFP

39 2) Cellule staminali embrionali (ES cells)
Le cellule ES sono cellule embrionali totipotenti, infatti possono dare origine a cellule di tessuti differenti. Le cellule ES vengono prelevate dalla massa cellulare interna della blastocisti(cellula embrionale indifferenziata) e mantenute in coltura in presenza di cellule o fattori che ne impediscono il differenziamento. In queste condizioni le cellule ES mantengono intatta la loro capacità di differenziarsi in modo appropriato in qualunque tessuto, una volta reintrodotte in un embrione

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44 Integrazione Sito specifica IDENTIFICAZIONE di ES CELLS con TRANSGENE
CALCIO FOSFATO Il DNA a contatto con una soluzione di fosfato di calcio forma dei precipitati i quali, con un meccanismo poco noto (probabilmente per endocitosi) entrano nelle cellule LIPOSOMI Lipidi che permettono la formazione di vescicole liposomiali Il DNA all’interno entra nella cellula mediante fusione vesciola-membrana Integrazione Sito specifica ELETTROPORAZIONE Scarica elettrica che altera la permeabilità della membrana generando “buchi” e permettendo l’entrata di DNA esogeno IDENTIFICAZIONE di ES CELLS con TRANSGENE integrato nel sito corretto SELEZIONE POSITIVA/NEGATIVA PCR

45 SELEZIONE POSITIVA-NEGATIVA cellule ES
Seq di DNA per RICOMBINAZIONE OMOLOGA nel genoma bersaglio TRANSGENE di interesse Gene che conferisce resistenza alla G418 Geni della Timidina Kinasi (virus herpes simplex). In presenza di GANCICLOVIR: MORTE

46 SELEZIONE POSITIVA e NEGATIVA
ASPECIFICA SPECIFICA Aggiunta di G418: SELEZIONE POSITIVA di cellule che hanno INTEGRATO il DNA Aggiunta di GANCICLOVIR: SELEZIONE NEGATIVA di cellule con INTEGRAZIONE ASPECIFICA

47 METODO della SELEZIONE POSITIVA e NEGATIVA
non è infallibile ma ARRICCHISCE la popolazione delle ES cells in elementi con TRANSGENE integrato nel sito CORRETTO

48 PCR SPECIFICA ASPECIFICA

49 Utilizzo ES cells: DISTROFIA Morbo di PARKINSON SCLEROSI MULTIPLA
Patologie neoplastiche Patologie non neoplastiche Disordini metabolici genetici Leucemie mieloidi acute Aplasia midollare grave Mucopolisaccaridosi Leucemie linfoidi acute Emoglobinuria parossistica notturna Tesaurismosi Leucemie mieloidi croniche Anemia di Fanconi Altri disturbi metabolici rari Sindrome mielodisplastica Anemia di Blakfan-Diamond Linfoma non Hodgkin Talassemie Linfoma di Hodgkin Anemia falciforme Leucemia linfatica cronica Altre emoglobinopatie Mieloma Multiplo Immunodeficienza grave combinata Leucemia a cellule capellute Osteopetrosi