PIANTE TRANSGENICHE.

Presentazione sul tema: "PIANTE TRANSGENICHE."— Transcript della presentazione:

1 PIANTE TRANSGENICHE

2 PRODUZIONE di PIANTE TRANSGENICHE
IMPORTANTE caratteristica delle cellule vegetali: TOTIPOTENZA Questa caratteristica è alla base della possibilità di creare piante transgeniche la possibilità di rigenerare un’intera pianta da singole cellule differenziate in vitro è possibile ri-generare un organismo vegetale variando il rapporto di auxina e citochinina (ormoni vegetali che regolano proliferazione e differenziamento) •CALLI :ammassi cellulari sdifferenziati propagabili in vitro all'infinito. •GERMOGLI •RADICI

3 RIGENERAZIONE DI PIANTE IN VITRO

4 RIGENERAZIONE DI PIANTE IN VITRO
Foglia sterilizzata Auxina/Citochina CALLO Auxina/Citochina GERMOGLI Auxina/Citochina RADICI

5 RIGENERAZIONE DI PIANTE IN VITRO
radici germogli Auxina/Citochina Auxina/Citochina

6 PRODUZIONE di PIANTE TRANSGENICHE Agrobacterium tumefaciens
Bombardamento

7 Agrobacterium tumefaciens
Batterio del suolo Gram- Fitopatogeno che trasforma geneticamente le piante colpite COLPISCE LE DICOTILEDONI (vite, rose, piante frutto carnoso e seme legnoso)

8 Agrobacterium tumefaciens
Il batterio è attirato da composti fenolici escreti dalla ferita della piante Plasmide Ti (induttore del Tumore) Contiene il T-DNA (transfer DNA) T-DNA 12-24Kb

9 Agrobacterium tumefaciens
Il batterio è attirato da composti fenolici escreti dalla ferita della piante Queste sostanze ATTIVANO i geni VIR (7/8) del plasmide Ti L’attivazione dei geni VIR è necessaria per l’integrazione nel DNA della pianta T-DNA è trasferito come molecola lineare a singolo filamento con meccanismo simile a coniugazione batterica Le regioni ripetute alle estremità (25bp) IMPORTANTI per meccanismo di taglio e integrazione PRIMA: si attivano i geni VIR importanti per trasferimento T-DNA DOPO: si attivano i geni del T-DNA AUXINA-CITOCHINA-OPINA Fonte di Carbonio utilizzabile solo da A.t.

10 Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE
Svantaggi: Auxine/Citochine prodotte dal T-DNA impediscono corretta rigenerazione della pianta Produzione dell’Opina non è utile per la pianta (dannosa?) Plasmidi Ti sono grandi ( Kb) Plasmidi Ti non hanno ORI

11 Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE
2 METODI 1) VETTORE BINARIO Neomicina trasferasi Resistenza alla Kanamicina Per amplificare il plasmide in E.Coli geni VIR Aiuta il trasferimento del T-DNA del VETTORE BINARIO No geni VIR

12 Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE
2) VETTORE COINTEGRATO RICOMBINAZIONE

13 1) VETTORE BINARIO 2) VETTORE COINTEGRATO

14 E.coli A. tumefaciens

15 TRASFORMAZIONE DEL TABACCO

16 Agrobacterium tumefaciens per produzione di PIANTE TRANSGENICHE
DICOTILEDONI MONOCOTILEDONI Alcuni protocolli elaborati hanno permesso l’utilizzo di A.tumefaciens anche in mais e riso

17 Bombardamento Utilizzato per la maggior parte delle Monocotiledoni Trasformazione mediata da microproiettili rivestiti da DNA Utilizzato per saggi RAPIDI BASSA frequenza di integrazione stabile ed ereditabile del DNA nel genoma della pianta Possibilità di inserzioni MULTIPLE Utilizzato per inserire DNA in: Monocotiledoni Sospensioni di cellule vegetali Colture di callo Embrioni immaturi Polline di molte piante Mitocondri e cloroplasti

18 Il DNA si integra nel genoma mediante meccanismi non noti
Bombardamento Particelle d’oro o tungsteno,ricoperte da DNA (precipitato con CaCl2/spermidina) sono accelerate a m/s con un “cannone da particelle” (polvere da sparo, elio, aria compressa) A questa velocità il DNA supera la parete vegetale e penetra nel NUCLEO Il DNA si integra nel genoma mediante meccanismi non noti

19 anche in cloroplasto/mitocondrio
Agrobacterium e Bombardamento Infetta solo DICOTILEDONI Infetta MONOCOTILEDONI DICOTILEDONI EMBRIONI etc Introduzione del DNA solo nel NUCLEO Introduzione del DNA anche in cloroplasto/mitocondrio

20 ALTRI METODI

21 Preparazione PROTOPLASTO

22 ORGANISMO MODELLO: Arabidopsis Thaliana

23 L’ Arabidopsis thaliana è un ottimo ORGANISMO MODELLO:
Le piccole dimensioni Il breve ciclo vitale Il piccolo genoma (più piccolo tra tutte le piante 125 Mb)

24 L’ Arabidopsis thaliana è un ottimo ORGANISMO MODELLO:
Facilità nel divenire transgenica Notevole disponibilità di mutanti Elevata produzione di semi (1 pianta: semi) d:0,5mm

25 GFP: Green Fluorescent protein
Utilizzo di GENI REPORTER nelle cellule vegetali trasformate Importante poter rilevare se la trasformazione è avvenuta GFP: Green Fluorescent protein LUCIFERASI GUS: -D-glucuronidasi

26 GUS: -D-glucuronidasi GENE reporter uidA codifica per GUS
da E.coli GENE reporter uidA codifica per GUS Numerosi glucorinidi possono essere usati come substrato della reazione enzimatica: Colorazione istochimica: X-Gluc Saggi spettrofotometrici: il p-nitrofenil β-D-glucuronide Saggi fluorimetrici: il 4-metilumbelliferil-beta-D-glucuronide

27 Studio dei PROMOTORI/ENHANCER
(promoter trap/enhancer trap) PROMOTOREassente/PROMOTOREminimo Gene REPORTER Per amplificare il plasmide in E.Coli Neomicina trasferasi Resistenza alla Kanamicina/G418

28 ENHANCER TRAP (GUS)

29 ENHANCER TRAP (GFP)

30 GAL4/GFP-ENHANCER TRAP

31 COLLEZIONE di Arabidopsis GAL4/GFP-ENHANCER TRAP

32 Trasferimento di DNA nei CLOROPLASTI
Organello necessario per la produzione di Energia. Contiene proprio DNA con genoma circa 105 volte più piccolo del genoma vegetale La maggior parte delle piante superiori contiene nelle cellule fogliari circa 100 cloroplasti. Ogni cloroplasto contine circa 100 copie del DNA del cloroplasto Trasformazione deve avvenire SOLO nel CLOROPLASTO e in TUTTI i CLOROPLASTI UTILIZZO di segnali di trascrizione di tipo PROCARIOTICO

33 Trasferimento di DNA nei CLOROPLASTI
bombardamento Trasformazione con SINGOLO vettore spectinomicina puo’ conferire problemi alle seq omologhe al DNA Resistenza alla spectinomicina Trasformazione con vettore DOPPIO Resistenza alla kanamicina

34 Produzione di piante transgeniche SENZA MARCATORI
Neomicina trasferasi Resistenza alla Kanamicina Per amplificare il plasmide in E.Coli I GENI MARCATORI (resistenza NEOMICINA/SPECTINOMICINA) POTREBBERO ESSERE TOSSICI e/o ALLERGENICI quando ingeriti Geni per la resistenza agli antibiotici potrebbero passare a batteri della flora intestinale

35 STRATEGIE per la produzione di piante transgeniche SENZA MARCATORI
Utilizzo del GENE MARCATORE e sua successiva rimozione Utilizzo di due costrutti (GENE ESTRANEO + GENE RESISTENZA) Successiva segregazione dei due costrutti 3) Abolizione dell’uso del GENE MARCATORE: screening per PCR