La trasformazione batterica: batteri (Streptococcus pneumoniea) avirulenti (ceppo R) sono trasformati in batteri virulenti (ceppo S) da batteri virulenti.

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1 La trasformazione batterica: batteri (Streptococcus pneumoniea) avirulenti (ceppo R) sono trasformati in batteri virulenti (ceppo S) da batteri virulenti (ceppo S) uccisi dal calore Uccisione con il calore Ceppo S Ceppo R Ceppo S ucciso dal calore Ceppo S Ceppo R DNA Ceppo R Ceppo S trasformazione proteine lipidi polisaccaridi RNA Nessuna trasformazione trasformazione

2 Linfezione di cellule del batterio Escheirichia coli da parte del fago T2 avviene mediante il DNA del virus, non mediante le sue proteine 32 P 35 S Solo nel DNA Solo nelle proteine La radioattività (e il DNA) entra La radioattività (con le proteine) non entra

3 Citosina H H C C C C N H N O C N H Le basi azotate - +..... + -..... N C C N C H C N N N H H C C H Adenina N C C N C H C N N O C C Guanina N H H H + -........ - +......... + -.......... C C C H H C C N H N H O O C Timina H Purine Pirimidine

4 La struttura del DNA H H HO H H2C5 H2C5 O BASE ….. C4C4 C3C3 C2C2 C1C1 H H P O-O- O-O- O O P P 5 5 3 3 1 1 P P 1 1 5 5 3 3 Legami idrogeno A TCG Legami idrofobici Nucleotide Il DNA è costituito da due catene polinucleotidiche antiparallele avvolte tra loro a doppia elica

5 Il modello della doppia elica del DNA Dati cristallografici: la figura ottenuta dalla diffrazione dei raggi x suggeriva che il DNA è una lunga molecola lineare, costituita a due filamenti paralleli avvolti a doppia elica Dati chimici: 1) Le molecole puriniche sono nello stesso numero delle molecole pirimidiniche (A+G=T+C); 2) Ciascuna delle molecole puriniche ha una e una sola molecola pirimidinica in uguale numero e precisamente: A=T, G=C Conoscenze preesistenti: il DNA è un polimero costituito da un numero molto elevato di subunità: i nucleotidi (fosfato + desossiribosio + 1 base azotata) Originalità del modello di Crick e Watson: la complementarità di coppie di basi (una purina e una pirimidina) che con i loro legami idrogeno stabilizzano la struttura a doppia elica e che, mediante la separazione dei due filamenti polinucleotidici e lincoprorazione di nucleotidi complementari sullo stampo dei filamenti preesistenti, garantiscono la precisione della replicazione del DNA e la correttezza della trasmissione ereditaria Ammettendo che le basi azotate si trovino allinterno della doppia elica, solo laffacciamento di una purina con una pirimidina garantiscono il diametro realmente riscontrato della doppia elca ACAC ACAC TGTG TGTG

6 Replicazione semiconservativa: lesperimento di Meselson e Sthal Prima generazione Seconda generazione Incubazione di cellule pesanti in 14 N Centrifugazione di DNA in gradiente di cloruro di cesio. Le colture cresciute per molte generazioni in un terreno contenente 15 N e 14 N forniscono le posizioni di controllo per le bande di DNA pesante e leggera. 15 N 14 N controlli Bande di DNA pesante e leggera Quando le cellule fatte crescere in 15 N vengono trasferite in un terreno 14 N, la prima generazione produce una banda di DNA intermedia e la seconda produce due bande, una intermedia e una leggera. Replicazione semiconservativa Una banda 15 N 14 N Due bande 15 N 14 N e 14 N 14 N Solo il modello semiconservativo di replicazione di DNA spiega questi risultati conservativa Una banda intermedia tra 15 N 14 N e 14 N 14 N dispersiva Una banda 15 N 14 N Due bande 15 N 15 N e 14 N 14 N 15 N 14 N

7 Replicazione semiconservativa del DNA nei cromosomi degli eucarioti G1G1 S BrUdR G2G2 Mitosi (M 1 ) G1G1 S BrUdR G2G2 Mitosi (M 2 ) 2n Blocco della M 1 con colchicina 4n

8 La forca replicativa 5 5 3 3 girasielicasi SSBprimasi RNA primer DNA polimerasi III DNA polimerasi IDNA ligasi frammento di Okazaki leading strand lagging strand Correzione di bozze Lincorporazione di nucleotidi sbagliati causa una distorsione della doppia elica; la DNA polimerasi rimuove il nucleotide sbagliato e inserisce quello corretto

9 I cromosomi degli eucarioti e il DNA 1) Misure viscosimetriche e microspettrofotometriche in neuroblasti di Drosophila: conoscendo la quantità totale di DNA per nucleo diploide (microspettrofotometria) e la lunghezza media delle molecole di DNA estratte (viscosimetria) si è verificato che ogni cromosoma è costituito da ununica molecola di DNA Quantità di DNA corrispondente a circa 10 8 coppie di nucletidi Lunghezza media delle molecole: circa 1,25x10 7 coppie di nucleotidi 2) Misure metriche e microspettrofotometriche in cromosomi a spazzola di oociti di Urodeli: conoscendo la quantità totale di DNA per nucleo diploide (microspettrofotometria) e la lunghezza media delle fibre di cromatina estese con microaghi a partire dai cromomeri, verificando che tali fibre sono frammentate solo con luso di endonucleasi, e che, quindi, la loro continuità è dovuta al DNA, si è verificato che ogni cromosoma è costituito da ununica molecola di DNA cromomero Quantità di DNA corrispondente a circa 10 9 coppie di nucletidi Lunghezza corrispondente a circa 10 9 coppie di nucletidi endonucleasi Il genoma aploide umano consta di circa 3 miliardi di nucleotidi, organizzati in 23 molecole a doppia lica di DNA, corrispondenti ai 23 cromosomi dellassetto aploide umano

10 La struttura dei cromosomi degli eucarioti DNA Ottamero di istoni Nucleosoma Cromatina Solenoide Impalcatura nucleare Impalcatura cromosomica Condensazione cromosomica (mitosi, meiosi)

11 La replicazione negli eucarioti e il telomero Origini di replicazione: singola nei procarioti, multiple negli eucarioti Negli eucarioti, quando si avvicina la forca replicativa, gli istoni vengono rimossi per consentire lazione del complesso di replicazione; a replicazione avvenuta avviene di nuovo laggregazione degli istoni a formare i nucleosomi …TTAGGG3TTAGGG Allestremità 3 del lagging strand, dopo la rimozione del primer, la DNA polimerasi non può operare Interviene un enzima ad RNA, la telomerasi che allunga il lagging strand allestremità 3 aggiungendo copie della sequenza telomerica ripetuta …CCCAATGGG… Il filamento allungato si ripiega più volte a formare unelica quadrupla, stabilizzata da un legame particolare tra 4 guanine affacciate G-G Lallungamento del filamento allestremità 3 offre spazio ulteriore allRNA primer che consente alla DNA polimerasi di operare, evitando laccorciamento del DNA TTAGGG…

12 DNA ripetitivo negli eucarioti DNA altamente ripetitivo (satellite): 10 5 – 10 6 copie di sequenze fra loro adiacenti di 10-100 nucleotidi Sequenza base 10 5 – 10 6 copie Localizzazione: p. es. eterocromatina centromerica DNA mediamente ripetitivo: 10 3 – 10 5 copie di sequenze intersperse di 200-500 nucleotidi Localizzazione: lungo tutti i cromosomi Sequenza base 10 3 – 10 5 copie Geni a copia multipla adiacenti mediamente ripetitivi: 10 2 – 10 3 copie degli stessi geni Uno o pochi geni 10 2 – 10 3 copie Localizzazione: p. es. geni per RNA ribosomale, braccio corto dei cromosomi umani 13, 14, 15, 21, 22 Minisatelliti: 10 3 – 10 4 copie di sequenze fra loro adiacenti di 10-100 nucleotidi Sequenza base 10 3 – 10 4 copie Localizzazione: siti specifici di cromosomi specifici Microsatelliti: 10 – 10 2 copie di di-, trinucleotidi fra loro adiacenti CAG…………….CAG Localizzazione: siti specifici di cromosomi specifici, anche entro geni Gene della corea di Huntigton Microsatellite (CAG) n

13 Cromosomi di cloroplasti e mitocondri I cromosomi di cloroplasti e mitocondri sono circolari, come quelli dei procarioti hanno ununica origine di replicazione hanno geni in ununica copia, senza intervalli non codificanti I cromosomi dei cloroplasti hanno 100.000 – 300.000 basi sono presenti in più copie entro lo stesso organello cloroplasto mitocondrio I cromosomi dei mitocondri non sono autosufficienti: sono necessarie anche istruzioni dei geni nucleari per il funzionamento dell organello hanno 16.000 – 300.000 basi hanno alcune duplicazioni e intervalli non codificanti È stata formulata lipotesi che questi organelli siano il risultato dellevoluzione di procarioti simbionti allinterno delle primitive cellule eucariotiche geni singoli geni duplicati non effettuano alcun crossing over

14 Meccanismi molecolari del crossing over Le 2 doppie eliche di DNA appartengono a 2 cromatidi non fratelli di 2 cromosomi omologhi A a B b 1) Si producono 2 rotture a singolo filamento 2) Le 2 rotture a singolo filamento vengono saldate mediante uno scambio a singolo filamento Aa B b Ruotando la figura precedente in modo da evitare accavallamenti, si ottiene questa configurazione di DNA cruciforme, effettivamente osservato in meiosi di lievito Aa B b 3) Si possono produrre 2 rotture a singolo filamento sui due filamenti di DNA non coinvolti negli scambi precedenti 4) Si saldano le 2 rotture con uno scambio a singolo filamento A a B b Ruotando la figura precedente, si osserva che si è compiuto il crossing over B b DNA eteroduplex Se prima delle rotture del punto 3 avviene uno scorrimento dei filamenti del DNA, si possono formare dopie eliche ibride (eteroduplex) Aa B b

15 Aminoacidi e proteine CC H NH 2 R O HO CC H NH 2 O HO R NH aminoacido 1aminoacido 2 legame peptidico dipeptide H2OH2O elica foglietto struttura primaria: sequenza lineare degli aminoacidi struttura secondaria: avvolgimenti o ripregamenti elementari della catena polipeptidica, dovuti a legami idrogeno tra aminoacidi vicini nella sequenza lineare struttura terziaria: struttura tridimensionale della catena polipeptidica dovuta alle interazioni fra aminoacidi anche lontani nella sequenza lineare C N struttura quaternaria: composizione di più catene polipeptidiche, uguali o diverse, a formare una proteina multimerica omodimero In ultima analisi le strutture secondaria, terziaria e quaternaria sono dovute alla struttura primaria

16 Un gene una catena polipeptidica Alleli diversi possono differire per la sostituzione di un solo aminoacido in una catena polipeptidica Frammentando progressivamente un polipeptide, è possibile averne unimpronta digitale (fingerprinting) attraverso lo spostamento dei frammenti in 2 diversi solventi: così è possibile identificare il frammento che differisce fra lallele normale e quello mutato, fino a individuare laminoacido cambiato Nella catena dellemoglobina umana, laminoacido in posizione 6 è lacido glutammico nellallele normale dellemoglobina A (HbA) ed è la valina nellallele mutato dellemoglobina S (HbS) Colinearità tra gene e catena polipeptidica Mediante lanalisi di cotrasduzione con il fago P1, si sono mappate diverse mutazioni in diversi siti del gene TrpA (per la sintesi del triptofano) in Escheirichia coli Mediante lanalisi di fingerprinting si sono localizzati, nella catena polipeptidica, le posizioni degli aminoacidi caratteristici di ciascuna mutazione mappata N 15 22 49 175 15: Lys->STOP; 22: Phe->Leu; 49: Glu->Val,Gln,Met; 175: Tyr->Cys. La sequenza dei siti mutati nel gene è identica alla sequenza delle posizioni degli aminoacidi sostituiti, anche se le distanze non corrispondono esattamente

17 Struttura dellRNA C C C C N H N H O O C Timina C H H H H P P 5 5 3 3 1 1 P P 5 5 3 3 1 1 A UCG OH desossiribosio H HO H H2C5 H2C5 O BASE ….. C4C4 C3C3 C2C2 C1C1 H P O H O-O- O-O- O ribosio H Uracile RNA compl. DNA A C G T DNA RNA trascritti Filamenti di RNA non ibridato Ibrido RNA-DNA 4 3 2 1 3 2 12 11

18 La Trascrizione TGTTGACATATAAT -35 -10 11-15 nucl 5-8 nucl Sito di inizio promotore terminazione C-G G-C C-G G-C RNA rRNA80%23S, 18S, 5S tRNA15%4S mRNA5%vario Tipo abbondanza coeff. sed. anticodone Sito di attacco dellaminoacido

19 La trascrizione e il processamento dellRNA negli eucarioti Negli eucarioti lRNA prima di entrare nel citoplasma subisce una maturazione: al 5 viene aggiunta una 7-metilguanosina, al 3 una catena di poli-A AAAA Non tutto lmRNA viene tradotto: una parte, corrispondente agli introni dei geni, viene staccato e rimosso; laltra parte, corrispondente agli esoni dei geni, viene saldata e tradotta Regione centrale del promotore TATAAAASito di inizioGGCCAATCT 25-30 nucl promotore RNA polimerasi II Intensificari Fattori di trascrizione r.c.p Nucleo snurp

20 Le mutazioni Le mutazioni sono cambiamenti accidentali, casuali ed ereditabili del materiale genetico Le mutazioni geniche consistono nel cambiamento di un gene da una forma allelica allaltra. Le mutazioni cromosomiche strutturali consistono in riordinamenti dei cromosomi che portano alla perdita, allacquisto o allo spostamento di geni. Le mutazioni cromosomiche numeriche consistono in cambiamenti del numero dei cromosomi che portano alla perdita oallacquisto di geni. A B DCc C C C

21 Natura molecolare delle mutazioni geniche Sostituzione di base A G T C transizione trasversione TAGAGTAG T T Delezione di base Inserzione di base TAG AGTAG purina pirimidina TAG CODICE GENETICO Per codificare 20 aminoacidi, non bastano 4 nucleotidi e nemmeno 16 coppie di nucleotidi; sono necessarie combinazioni di almeno 3 nucleotidi (triplette) che sono 64 TAG 123 132tripletta Lettura per giustapposizione Lettura per sovrapposizione

22 Natura del codice genetico TATAG 123 132tripletta CG Se la lettura del codice fosse stata per sovrapposizione, una singola sostituzione di base avrebbe comportato la modificazione di tanti aminoacidi quante sono le basi che fanno parte dellunità codificante (nellesempio presente, supponendo un codice a triplette, gli aminoacidi modificati da una singola sostituzione di base avrebbero dovuto essere 3); invece si osserva la modificazione di un solo aminoacido; pertanto la lettura del codice è per giustapposizione. rII+rII proflavina FCO soppressore rII+ rII +-+- rII+rII proflavina rII proflavina rII+ 2 mutazioni successive di segno opposto (inserzione + delezione), separabili per crossing over, ripristinano la corretta cornice di lettura; quindi il codice è letto senza interruzioni e le sfasature dovute alla prima mutazione si mantengono a valle di essa fino a che non sono neutralizzate dalla seconda 3 mutazioni successive dello stesso segno, separabili per crossing over (3 inserzioni o 3 delezioni) ripristinano la corretta cornice di lettura; le sfasature dovute alla prima mutazione si mantengono a valle di essa fino a che non sono neutralizzate dalla seconda e dalla terza; quindi il codice è a triplette TAG TTAG TAG AG TAG TG TA TAGAG

23 Decifrazione del codice genetico UUU27/64 UUG, UGU, GUU9/64 UGG, GUG, GGU3/64 GGG1/64 UUU Phe Costruendo un mRNA in vitro costituito di un unico nucleotide (X), ci sarà una sola tripletta (XXX); effettuando la sintesi proteica in vitro, si formerà un polipeptide costituito da un unico aminoacido (Z-Z-Z-…), codificato dalla tripletta XXX Costruendo un mRNA in vitro costituito di una miscela di nucleotidi (X e Y) in proporzioni note (p e q), ci sarà una miscela di triplette in proporzioni prevedibili (p 3 XXX; p 2 q XXY, XYX, YXX; pq 2 XYY, YXY, YYX; q 3 YYY); effettuando la sintesi proteica in vitro, si formerà un polipeptide costituito da una miscela di aminoacidi nelle stesse proporzioni delle triplette che li codificano U:G = 3:1 Phe27/64 Val12/64 Leu, Cys9/64 Gly4/64 Trp3/64 Usando mini mRNA (1 sola tripletta), capaci di determinare il legame tra il tRNA complementare e il suo aminoacido consentendone lidentificazione, e mRNA costituiti da copolimeri ripetitivi della stessa tripletta (XYW)n, si è completamente decifrato il codice genetico

24 I codoni UUU Phe UUC Phe UUA Leu UUG Leu UCU Ser UCC Ser UCA Ser UCG Ser UAU Tyr UAC Tyr UAA STOP UAG STOP UGU Cys UGC Cys UGA STOP UGG Trp CUU Leu CUC Leu CUA Leu CUG Leu CCU Pro CCC Pro CCA Pro CCG Pro CAU His CAC His CAA Gln CAG Gln CGU Arg CGC Arg CGA Arg CGG Arg AUU Ile AUC Ile AUA Ile AUG Met ACU Thr ACC Thr ACA Thr ACG Thr AAU Asn AAC Asn AAA Lys AAG Lys AGU Ser AGC Ser AGA Arg AGG Arg GUU Val GUC Val GUA Val GUG Val GCU Ala GCC Ala GCA Ala GCG Ala GAU Asp GAC Asp GAA Glu GAG Glu GGU Gly GGC Gly GGA Gly GGG Gly I codoni sono le triplette di basi di mRNA che codificano per specifici aminoacidi; sono complementari e antiparallele sia alle corrispondenti triplette sul DNA del gene trascritto, sia a quelle degli anticodoni, presenti sul tRNA corrispondente; la prima base è allestremità 5, lultima allestremità 3 Il codice genetico non è ambiguo: ogni codone codifica per un solo aminoacido Il codice genetico è degenerato: molti aminoacidi sono codificati da più di un codone Il codice genetico è universale: quasi tutti i viventi condividono lo stesso codice genetico

25 Anticodoni e tRNA Ogni specie di tRNA ha un anticodone specifico e lega un solo aminoacido DEGENERAZIONE DEL CODICE 1) Alcuni aminoacidi si legano a più di un tRNA 2) Alcune basi allestremità 5 dellanticodone (corrispondenti allultima base, in 3, del codone) presentano un appaiamento non stringente (vacillamento) che riconosce più di una base in 3 del codone; quindi alcuni tRNA riconoscono più di un codone GU, C CG AU UA, G IU, C, A al 5 dellanticodoneal 3 del codone CODONI NON SENSO UAA, UAG, UGA 1) Usati come mini mRNA non legano alcun aminoacil-tRNA 2) Prodotti in seguito a una singola sostituzione di base a partire da triplette molto simili, producono, in corrispondenza della loro posizione, uninterruzione della catena polipeptidica (mutazioni non senso) 3) Le mutazioni non senso possono essere neutralizzate da mutazioni soppressori esterne al gene: si tratta di mutazioni nellanticodone di un tRNA (p.es. GUA -> UUA, anticodone di UAA) I codoni non senso sono detti di terminazione perché interrompono la sintesi di una catena polipeptidica

26 Sintesi proteica e traduzione 50 S 30 S 23 S (28S) 16 S (18S) 5 S Il sito di inizio della traduzione nellmRNA è una tripletta AUG, GUG preceduta di poco da sequenze complementari allrRNA 16 S; tale tripletta codifica per N- formil-metionina (in E. coli) Sito ASito P aa2 aa3 aa1 aa2 aa1 il tRNA con lanticodone complementare al codone esposto nel sito A vi si lega, essendo già associato al proprio aminoacido (aminoacil-tRNA) Sul sito P è presente un tRNA entrato in precedente, cui è legato il nascente polipeptide (peptidil-tRNA);il polipeptide si stacca dal tRNA sul sito P e si lega allaminoacido legato al tRNA sul sito A Il tRNA libero sul sito P si allontana, il codone e il peptidil-tRNA sul sito A si spostano sul sito P Quando sul sito A giunge un codone di terminazione, al posto di un tRNA vi si lega un Fattore di Rilascio che impedisce lallungamento del poipeptide e conclude il processo