PEPTIDE SYNTHESIS.

Presentazione sul tema: "PEPTIDE SYNTHESIS."— Transcript della presentazione:

1 PEPTIDE SYNTHESIS

2 PEPTIDI Molecole di peso molecolare inferiore ai 5000 dalton, costituiti da una catena di pochi amminoacidi (fino a 100 circa), uniti tra di loro attraverso un legame peptidico (amidico).

3 PEPTIDI Costituenti delle proteine Ormoni Neurotrasmettitori
Antibiotici/Antibatterici Veleni Partecipano alla risposta immunitaria Sviluppo di patologie Farmaci Nanotecnologie

4 PEPTIDI Ormoni Glucagone Insulina

5 PEPTIDI Neurotrasmettitori
Sintetizzati come pre-proteine del reticolo endoplasmatico rugoso dove viene rimossa la sequenza segnale. La pre-proteina risultante attraversa l’apparato di Golgi e viene immagazzinata in vescicole. All’interno delle vescicole si completa la formazione del peptide: scissione proteolitica, modificazione delle estremità del peptide, glicosilazione, fosforilazione, formazione dei ponti disolfuro.

6 PEPTIDI Antibatterici Proline-rich proteins Istatine Cistatine

7 PEPTIDI Veleni Conopeptidi

8 PEPTIDI Risposta immunitaria

9 Patologie legate ai peptidi: Alzheimer

10 PEPTIDI Insulina Ossitocina Antagonisti GnRH Peptide Radionuclide
Farmaci Insulina Ossitocina Antagonisti GnRH Peptide Radionuclide Receptor Therapy Somatostatina Ziconotide

11 PEPTIDI Farmaci Peptide Peptidomimetico
bassa stabilità metabolica scarso assorbimento dopo somministrazione orale scarso passaggio della barriera ematoencefalica Peptide Peptidomimetico

12 PEPTIDI Nanotecnologie

13

14

15 C'ERA UNA VOLTA...

16 1881 & 1902 Prima attivazione del gruppo carbossilico &
Sintesi di un tripeptide Theodor Curtius ( )

17 Prima sintesi chimica di un peptide “NH2 free”
1901 Prima sintesi chimica di un peptide “NH2 free” Emil Fischer (1852–1919) 1902 Nobel Prize “…la quantità di lavoro che c’è da fare è talmente enorme che in confronto le scoperte sui carboidrati sembrano un gioco da ragazzi.”

18 Introduzione del gruppo benzilossicarbonilico (Cbz o Z)
1932 Introduzione del gruppo benzilossicarbonilico (Cbz o Z) Max Bergmann ( ) & Leonidas Zervas ( )

19 Sintesi dell’Ossitocina Vincent du Vigneaud (1901-1978)
1953 Sintesi dell’Ossitocina Vincent du Vigneaud ( ) 1955 Nobel Prize

20 Introduzione del gruppo t-butossicarbonilico (Boc)
1957 Introduzione del gruppo t-butossicarbonilico (Boc) George W. Anderson & Anne McGregor J. Am. Chem. Soc., 1957, 79,

21 1963 J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, L-A-G-V

22 BRUCE MERRIFIELD ( ) 1984 Nobel Prize

23 Work-up per semplice filtrazione
BRUCE MERRIFIELD “la mia resa complessiva è stata del 7% e mi ci sono voluti 11 mesi. Sicuramente un chimico dei peptidi con più esperienza avrebbe fatto meglio, ma non senza uno sforzo considerevole” Legare covalentemente un aa ad un supporto insolubile e far “crescere” il peptide. VANTAGGI Work-up per semplice filtrazione Possibiltà di utilizzare i reattivi in grande eccesso Riduzione dei tempi di sintesi Automatizzazione del processo

24 LE TRE GRANDI SFIDE Bruce contro i chimici!!!
Passare dalla teoria alla pratica. Abbattere la resistenza dei chimici sintetici verso questo nuovo metodo (“…non è assolutamente chimica, è un approccio che verrà soppresso dalla comunità”). Far capire che anche un biochimico può avere le credenziali per proporre un cambiamento rivoluzionario nella sintesi chimica (“Questo non è il modo di sintetizzare i peptidi”).

25 Attacco –COOH. Allungamento facendo reagire il carbossile attivato con gruppo NH2 dell’aa o del peptide ancorato alla resina. SPPS: sequenza di coupling/deprotezione. Distacco del peptide dalla resina L-A-G-V

26 Introduzione del gruppo 9-Fluorenilmetossicarbonile (Fmoc)
1972 Introduzione del gruppo 9-Fluorenilmetossicarbonile (Fmoc) Louis A. Carpino

27 SPPS Side chain PG N-α PG Polymer Support couple CH C O R1 Linker HN
activating group couple n. times deprotection and coulping Rx+1 Rx OH n-1 SPPS Side chain PG N-α PG Polymer Support

28 SPPS Boc/Bzl SPPS Fmoc/tBu SPPS SCELTA DELLA RESINA
ALLUNGAMENTO DELLA CATENA (COUPLING/DEPROTEZIONE) DISTACCO DEL PEPTIDE DALLA RESINA PURIFICAZIONE Boc/Bzl SPPS GIOCO DI PROTEZIONI Fmoc/tBu SPPS

29 -N- -OH -COOH R -SH

30 PROTEZIONE ORTOGONALE
GRUPPO PROTETTORE chimicamente stabile nelle condizioni della sintesi peptidica effetto stabilizzante sulla molecola rimovibile in condizioni blande, in modo selettivo e con alte rese PROTEZIONE ORTOGONALE Stabile nelle condizioni di coupling e deprotezione Non stabile durante il distacco dalla resina (ci sono eccezioni) Stabile durante coupling Non stabile durante la deprotezione

31 Gruppi N protettori Boc Fmoc Stabile in ambiente basico e riducente
Eliminazione in ambiente acido (TFA) Stabile in ambiente acido Eliminazione con piperidina

32 Gruppi protettori delle catene laterali
Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Ala, Met non hanno bisogno di protezione Boc Fmoc stabili in TFA Stabili in piperidina Possono essere o non essere stabili nelle condizioni di cleavage della resina

33 Racemizzazione Ossazolone

34 tBu Bzl 2-Br-Bzl Trt

35 Cbz Boc Dnp For Trt

36 Bzl tBu Ada OcHx

37

38 Trt Xan Tmob

39 Mts Pmc Pbf

40 Acm Trt

41 Scelta della Resina Non deve essere solubile nei solventi utilizzati durante la sintesi Deve contenere siti reattivi (linkers) per permettere l’attacco del primo aa tramite la funzione carbossilica Deve essere stabile nelle condizioni di coupling-deprotezione La resina deve subire un rigonfiamento (swelling) per favorire la penetrazione dei reagenti nei granuli Loading: mmol di gruppo funzionale per g di resina

42 Scelta della Resina Struttura polimerica Polistirene PEG

43 Resine Boc-SPPS Stabili in TFA Resina di Merrifield

44 Resine Boc-SPPS

45 Resine Boc-SPPS Cleavage HF → Peptide acido
NH3/MeOH → Peptide carbossammide NH2NH2 → Peptide idrazide MeOH/TEA → Peptide metilestere

46 Resine Fmoc-SPPS Anidridi simmetriche Anidridi miste Metodo MSNT/MeIm
Resina di Wang Anidridi simmetriche Anidridi miste Metodo MSNT/MeIm

47 Anidridi simmetriche Resa >70% Racemizzazione

48 Anidridi miste Resa >70% Racemizzazione

49 Metodo MSNT/MeIm Evita racemizzazione Sensibile all’umidità

50 Resina Clorotritilica
Peptidi acidi No racemizzazione Resa quantitativa Peptidi protetti

51 Rink Amide Resin Sieber Amide Resin Peptidi carbossiammidati
Peptidi protetti (Sieber)

52 Resine Fmoc-SPPS Cleavage TFA 80-95% + Scavengers per 1-3 h Scavengers
Nucleofili che reagiscono con specie cationiche altamente reattive che si formano dai gruppi protettori e dalla resina Acqua 1,2 Etanditiolo (EDT) Tioanisolo Fenolo Triisopropilsilano (TIS) Reagent K TFA/tioanisolo/H2O/Fenolo/EDT

53 Coupling Gruppo attivatore

54 Carbodiimmidi DIC EDC DCC O-acilisourea Migrazione acilica O → N
Base O-acilisourea Base: DIEA, TEA, NMM, DMAP Migrazione acilica O → N Racemizzazione

55 Carbodiimmidi + HOBt HOAt HOSu HOOBt

56 Miscellanea

57 Coupling Reagents HOBt incorporato direttamente nella struttura dell’attivatore Sali di fosfonio BOP Sali di uronio HBTU

58 Sali di Fosfonio PyBOP

59 Sali di Uronio HATU TBTU HCTU

60 Siamo pronti! Fase liquida Fase Solida 1.1 eq. aa 1.1 eq. attivatore
1.1 eq. HOBt 2 eq. ammina 5 eq. aa 5 eq. attivatore 5 eq. HOBt 10 eq. ammina Gruppo COOH terminale protetto come estere Gruppo COOH terminale attaccato a resina Work-up: estrazione, purificazione Work-up: filtrazione

61 Problemi Sintesi in fase liquida: Solubilità del peptide Sintesi in fase solida: Capacità del gruppo amminico di affacciarsi al solvente

62 Risoluzione (Hmb)-amminoacidi Pseudoproline Isoacil dipeptidi
Evitare la formazione di legami idrogeno intermolecolari (Hmb)-amminoacidi Pseudoproline Isoacil dipeptidi Microonde

63 2-Hydroxy-4-methoxybenzyl
(Hmb)-amminoacidi 2-Hydroxy-4-methoxybenzyl N → O acyl transfer

64 Pseudoproline X= H, CH3

65 Pseudoproline

66 Isoacil Dipeptidi

67 Microonde

68 Ponti S-S Contribuiscono alla formazione della struttura tridimensionale di peptidi e proteine Importanti per l’attività Ossidazione di due residui di cisteina

69 2 AcOH/H2O I2, MeOH Ac. Ascorbico 1 H2O (40 μM) NaOH, TRIS H2O2

70 Distacco del gruppo Boc
Si aggiunge alla resina una soluzione di TFA in DCM (50%, 10 mL/g resina) e si lascia sotto agitazione per 5 min. Dopo la fitrazione si aggiunge ancora TFA/DCM e si agita per ulteriori 20 min. La resina viene poi lavata con DCM (2x) e IPA (2x).

71 Distacco del gruppo Boc (Fase liquida)
L’ammina N-Boc-protetta viene posta in un pallone ad un collo e raffreddata a 0°C con un bagno di ghiaccio. Successivamente viene aggiunta una soluzione di HCl in diossano (4M, 1mL per 100 mg) e la miscela di reazione viene lasciata sotto agitazione, a t.a. fino a quando la TLC non ha evidenziato la scomparsa del prodotto di partenza. Il solvente viene fatto evaporare ( HCl!) e il residuo ottenuto lavato con Et2O (x3).

72 Distacco del gruppo Fmoc
Si aggiunge alla resina una soluzione di piperidina in DMF (40%, 10 mL/g resina) e si lascia sotto agitazione per 5 min. Dopo la fitrazione si aggiunge ancora piperidina/DMF e si agita per ulteriori 15 min. La resina viene poi lavata con DMF (6x)

73 Introduzione del gruppo Boc
L’ammina libera viene dissolta in un solvente opportuno (10 mL/mmol) e alla soluzione viene aggiunta TEA (1 o 2 eq.) fino a pH basico ed infine Boc2O (2 eq.). La miscela di reazione viene lasciata sotto agitazione overnight. Al termine della reazione (controllo mediante TLC) si lava la fase organica con H20 e una soluzione satura di NaCl. La fase organica viene seccata con Na2SO4 anidro e fatta evaporare. Il grezzo ottenuto viene purificato mediante colonna cromatografica.

74 Introduzione del gruppo Fmoc
L’ammina cloridrata viene dissolta in una soluzione di Na2CO3 (0.6M, 7 mL/mmol) e alla soluzione viene aggiunto FmocOSu (2 eq.) sciolto in acetone (5 mL/mmol). La miscela di reazione è lasciata sotto agitazione per 24 h. Al termine della reazione (controllo mediante TLC) la miscela viene diluita con H2O e la fase acquosa estratta con AcOEt (3x). Le fasi organiche riunite vengono lavate con H2O e una soluzione satura di NaCl, seccate con Na2SO4 e fatte evaporare. Il residuo ottenuto viene purificato mediante colonna cromatografica.